豬呼吸道病毒性疫病多重PCR方法的建立與應(yīng)用研究.pdf

1、豬呼吸道疾病是影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的主要疾病之一，是目前我國規(guī)?；i場的常發(fā)病、多發(fā)病，已經(jīng)引起人們的普遍重視，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的危害和損失。豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬藍耳病病毒、豬瘟病毒、豬細小病毒和豬流感病毒是最為多見的豬病毒性呼吸道疾病病原，且在臨床上常呈混合或繼發(fā)感染。豬群中，多病原混合感染已是疾病發(fā)生的普遍特點，兩種或以上病原體共同感染導(dǎo)致豬群發(fā)病率和死亡率增高，使得疾病診斷和防治難度加大。為實現(xiàn)臨床多病原混合感染的快

2、速確診，本研究建立了針對上述6種病毒的多重PCR鑒別診斷方法，為相關(guān)疫病的快速診斷和防控提供了有效的技術(shù)手段。主要研究內(nèi)容如下：
　　1、PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV的單項PCR/RT-PCR方法的建立
　　參照NCBI中PRV gB（AF257079）、PCV2 ORF2（NC_005148）、PRRSV ORF6（NC_001961）、CSFV C（AY805221）、PPV NS1（NC_00

3、1718）、SIV M（GU086140）等基因序列，應(yīng)用相關(guān)軟件各設(shè)計了1對特異性引物，分別用于擴增PRV gB基因、PCV2 ORF2基因、PRRSV ORF6基因、CSFV C基因、PPV NS1基因和SIV M基因的部分序列，擴增的目的片段大小分別為192bp、255bp、364 bp、530 bp、759 bp和981bp，通過對目的基因的測序鑒定以及反應(yīng)的條件優(yōu)化，建立了PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV、SIV

4、的單項PCR/RT-PCR方法，為摸索建立多重PCR方法的條件打下基礎(chǔ)。
　　2、三重PCR及三重RT-PCR鑒別診斷方法的建立與初步應(yīng)用
　　在建立的PRV、PCV2、PRRSV、CSFV、PPV和SIV的單項PCR/RT-PCR方法的基礎(chǔ)上，以陽性病毒核酸為模板進行多重 PCR擴增及反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，分別得到與設(shè)計相符合的3條特異性條帶，建立了能同時檢測PRV、PCV2和PPV三種DNA病毒的三重PCR方法和能同

5、時檢測PRRSV、CSFV和SIV三種RNA病毒的三重RT-PCR方法。試驗結(jié)果表明該方法具有較好的敏感性和特異性，且均在56℃時檢測效果最好。該方法對臨床病料的檢測結(jié)果與單項PCR結(jié)果一致。
　　3、豬呼吸道病毒性疫病多重PCR鑒別診斷方法的建立與初步應(yīng)用
　　在建立的三重PCR方法及三重RT-PCR方法的基礎(chǔ)上，通過對多重 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，以及臨床應(yīng)用檢測，成功建立了能同時檢測PRV、PCV2、CSFV和SIV四種