豬輪狀病毒培養(yǎng)感染研究與間接夾心ELISA診斷方法的建立.pdf

1、豬輪狀病毒(Porcine Rotavirus)是危害養(yǎng)豬業(yè)的主要病毒性腹瀉病原之一，本研究以豬輪狀病毒OSU株為材料，對輪狀病毒的細胞培養(yǎng)關鍵技術、病毒感染仔豬的癥狀和病變進行了研究，并建立了檢測豬輪狀病毒的間接夾心ELISA方法。 本研究確立了豬輪狀病毒最佳培養(yǎng)條件，并進行了病毒人工感染試驗。病毒經20μg/mL 胰酶處理1h，接種細胞于37℃吸附2h，用含4μg/mL 胰酶的維持液(MEM)培養(yǎng)，連續(xù)傳至10代細胞出現(xiàn)葡萄

2、串狀堆積、胞漿相連、拉網等病變。透射電鏡觀察到病毒粒子呈圓形車輪狀，直徑約為80nm。病毒口服感染3日齡未食初乳仔豬，于感染后10h出現(xiàn)腹瀉，糞便呈黃色水樣混有白色絮狀物，接種后42h死亡。剖檢可見胃內有凝乳塊，腸壁變薄充滿液體，盲腸、結腸充氣。主要病理變化：腸腔內積有多量脫落的上皮細胞和炎性滲出物，其中混有紅細胞；腸上皮細胞變性、壞死、脫落；固有膜毛細血管高度擴張、充血，并伴有輕微出血；嚴重者粘膜上皮大量脫落，裸露出固有膜；粘膜下層水

3、腫、增厚，炎性細胞浸潤。 建立了檢測豬輪狀病毒抗原的間接夾心ELISA。采用超速離心從病毒細胞培養(yǎng)物提純病毒分別免疫豬和兔，制備的高免血清用硫酸銨沉淀法粗提IgG，再分別通過羥基磷灰石及陰離子交換層析，得到純化的豬抗RV IgG和兔抗RV IgG，建立檢測豬輪狀病毒的間接夾心 ELISA。試驗確定了ELISA最佳工作條件：豬抗RV IgG包被濃度為4μg/mL，4℃包被過夜；封閉液為1％牛血清白蛋白(BSA)，37℃封閉60mi

4、n；抗原孵育條件為37℃90min；兔抗RV IgG濃度為3.5μg/mL，37℃孵育90min；酶標羊抗兔抗體濃度為1：8000，37℃孵育90min；底物作用時間為15min。陰陽性結果判定的臨界OD值為0.161。重復性試驗表明該方法重復性較好。間接夾心ELISA不與豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒、豬細小病毒、乙腦病毒、大腸桿菌、豬傳染性胸膜肺炎桿菌呈現(xiàn)交叉反應，特異性好。敏感性試驗測定最低抗原檢出量為1.25μg