犢牛腹瀉輪狀病毒分離鑒定及RT-LAMP檢測(cè)方法的建立.pdf

1、輪狀病毒(BovineRotavims,BRV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬(Rotavims),是引起各種幼齡動(dòng)物病毒性腹瀉的主要病原之一。該病自報(bào)道以來,已在全世界主要養(yǎng)牛國家普遍發(fā)生和流行,給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。常用檢測(cè)方法有RT-PCR,EIASA等,可由于需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)人員而不便于在臨床普遍應(yīng)用,所以急需一種方便簡單的檢測(cè)方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermal

2、amplification,LAMP)通過具有鏈置換特性的BstDNA聚合酶完成靶序列的擴(kuò)增,僅需恒溫就能擴(kuò)增核酸,并可通過核酸染料染色或者離心沉淀觀察結(jié)果,較之普通的RT-PCR方法,具有簡便、快速的特點(diǎn)。
　　 對(duì)保定地區(qū)發(fā)病牛場(chǎng)的犢牛腹瀉病料進(jìn)行處理,得到疑似病毒液,然后將其接種到Marc-145細(xì)胞上,37℃CO2條件下盲傳四代后,細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、界限不清晰、崩解等病變。根據(jù)GenBank發(fā)表的牛輪狀病毒VP7基因序

3、列,設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物。用此引物對(duì)出現(xiàn)細(xì)胞病變的培養(yǎng)液進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),所得目的片段與預(yù)期片段長度(342bp)一致。將RT-PCR產(chǎn)物純化回收,進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化及序列測(cè)定,分析結(jié)果與預(yù)期的結(jié)果相同。對(duì)該毒株的理化特性鑒定結(jié)果表明:該株牛輪狀病毒不耐熱,對(duì)氯仿、強(qiáng)酸、乙醚有良好的抵抗力。證實(shí)本研究分離出的病毒為牛輪狀病毒,命名為BD株。
　　 本研究將建立檢測(cè)BRV的RT-IAMP檢測(cè)方法。根據(jù)GenBank中發(fā)表的BRV基因

4、序列,用DNAstar進(jìn)行分析和比對(duì)后發(fā)現(xiàn),VP7的基因序列相對(duì)保守,故針對(duì)VP7進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。利用PrimerExplorer4.0引物設(shè)計(jì)軟件,嚴(yán)格按照引物設(shè)計(jì)原則及注意事項(xiàng)進(jìn)行引物設(shè)計(jì),并對(duì)設(shè)計(jì)出的引物進(jìn)行篩選,最終確定一組,包括外引物F3、B3,內(nèi)引物FIP、BIY。用此引物對(duì)提取好的病毒RNA進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng),并對(duì)試驗(yàn)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,RT-LAMP最佳反應(yīng)溫度是62℃,反應(yīng)時(shí)間為50min;優(yōu)化的各組分濃度分

5、別為:Mg2+2.5μL,dNTPs3.5μL,BstDNA聚合酶1.5μL。;外引物和內(nèi)引物最佳濃度比為1:6,即外引物(F3:B3=1:1)共計(jì)為1μL,內(nèi)引物(FIP:BIP=1:1)共計(jì)為6μL。對(duì)經(jīng)過摸索條件后建立的反應(yīng)體系進(jìn)行靈敏度、特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn),結(jié)果表明,RT-LAMP的敏感性是RT-PCR的100倍;特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示無交叉反應(yīng)存在,說明該檢測(cè)技術(shù)特異性較好;批間和批內(nèi)的檢測(cè)結(jié)果無明顯差異,說明該檢測(cè)方法相