HIF-1α促進內(nèi)皮細胞血管新生的實驗研究.pdf

1、背景：內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC）是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，在胚胎或成年后缺血、創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下參與血管的新生。 1997 年Asahara 等在Science 上發(fā)表的文章提出：人外周血中分離得到的EPC 在體外培養(yǎng)可分化為內(nèi)皮細胞并表達內(nèi)皮特異性成分，在裸鼠下肢缺血模型中EPC 可參與新生血管的形成，這一發(fā)現(xiàn)為缺血性疾病提供了新的輔助治療手段，此后，國際上對于外周血EPC 移

2、植促血管新生的研究始終方興未艾。但是由于循環(huán)血中EPC 數(shù)量不足,限制了EPC 的廣泛應用。因此，如何通過各種措施增加EPC 數(shù)量已經(jīng)成為目前研究的焦點。低氧誘導因子-1α (Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是在低氧環(huán)境中起細胞調(diào)控作用的關鍵基因, 在缺血造成的低氧中發(fā)揮重要作用，但HIF-1α與干細胞尤其是EPC 的關系尚不清楚。 本研究分四部分試圖探討HIF-1α轉染到EPC 后的變化

3、，HIF-1α在EPC中的過表達是否有助于進一步促進EPC 的血管新生作用，為EPC 在促進血管新生和治療缺血性疾病的臨床應用方面提供理論基礎和新的實驗依據(jù)。 第一部分，HIF-1α轉染EPC 的初步探討。 目的：建立人外周血內(nèi)皮祖細胞（EPC）體外培養(yǎng)、誘導分化方法，觀察電穿孔轉染HIF-1α至EPC 后，EPC 在體外向內(nèi)皮細胞(endothelial cell, EC)分化的性質、擴增及遷移功能改變及對體內(nèi)缺血

4、下肢血管新生的影響。 方法：密度梯度離心法分離獲得人外周血單個核細胞，體外通過血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF）、成纖維細胞生長因子誘導、分化、擴增EPC 并鑒定。分子生物學技術構建HIF-1α特異性干擾質粒（siHIF-1α），電穿孔技術轉染HIF-1α或其干擾質粒，觀察基因修飾的EPC 形態(tài)學及功能學改變。 結果：體外培養(yǎng)所的EPC 7 天后CD34

5、+約30％，AC133+約10％，CD31+約33％,細胞保持EC 前體細胞特性并可定向向EC 分化；EPC內(nèi)的HIF-1α mRNA 在常氧及低氧下有表達，但其蛋白表達在常氧中不穩(wěn)定。電穿孔轉染GFP 空質粒的轉染效率約25％，低氧環(huán)境中轉染HIF-1α后的EPC 中HIF-1α、VEGF mRNA 及蛋白表達升高，可被特異性siHIF-1α中度抑制; 功能學檢測示HIF-1α過表達增加了EPC在體外的分化、擴增、遷移；EC 標記物C

6、D31、VEGFR2、eNOS 及VEGF、NO 分泌增加；移植HIF-1α?EPC 至缺血下肢后可見外源性EPC 存在于缺血部位； HIF-1α?EPC 較對照組進一步促進體內(nèi)毛細血管數(shù)目增加。 結論：在體外，HIF-1α修飾的EPC 不影響其前體細胞性質，可促進EPC 擴增及遷移功能改善；在體內(nèi)，HIF-1α?EPC 有助于促進缺血下肢的局部血管新生。 第二部分，腺病毒介導HIF-1α體外感染EPC 的實驗研究。

7、 目的：改進轉染方法，通過腺病毒介導HIF-1α至EPC，提高了感染效率，觀察腺病毒介導的HIF-1α在EPC 中的過表達是否在體外有利于促進EPC 的成血管活性。 方法：在體外構建人HIF-1α基因腺病毒載體(Ad-HIF-1α)及其siRNA 抑制載體(Ad-si HIF-1α)；通過腺病毒介導人HIF-1α基因(Ad-HIF-1α)入EPC，觀察感染后EPC 在體外的擴增及遷移功能改變。 結果：以MOI

8、 為70 感染各組細胞6 h 后，熒光顯微鏡觀察轉染效率80％以上并持續(xù)至少1 月，未發(fā)現(xiàn)明顯的腺病毒感染引起的凋亡；感染Ad-HIF-1α后的EPC 在體外細胞擴增數(shù)成倍增加，遷移功能改善(P<0.05)，感染Ad-siHIF-1α后的EPC 擴增及遷移功能受抑制。 結論：在體外，通過腺病毒介導的方法基因修飾EPC 初步認為高效，細胞損傷小，體外Ad-HIF-1α感染EPC 增加了EPC 的成血管活性，為進一步在體內(nèi)實驗奠定

9、了基礎。 第三部分，Ad-HIF-1α-EPC 對裸鼠缺血下肢血管新生的影響。 目的：觀察腺病毒介導的HIF-1α在EPC 中的過表達在體內(nèi)是否有利于促進下肢局部缺血的恢復。 方法：實驗性下肢缺血的裸鼠造模，術后7 天觀察造模是否成功；在體外通過腺病毒感染的方法介導人HIF-1α基因(Ad-HIF-1α)入EPC，經(jīng)尾靜脈將Ad-HIF-1α?EPC 注入實驗性下肢缺血的裸鼠；基因及蛋白水平觀察HIF-1α

10、的轉入；28 天后大體標本觀察缺血下肢的恢復情況；毛細血管計數(shù)；TTC 法觀察缺血面積；局部溫度測定及下肢多普勒血流測定。 結果：裸鼠左下肢股動脈部分結扎切除術后7 天造成下肢缺血，經(jīng)尾靜脈移植異種Ad-HIF-1α?EPC 至裸鼠鼠缺血下肢后28 天Ad-GFP-EPC 組及Ad-HIF-1α?EPC 組均未發(fā)現(xiàn)下肢自體離斷，Ad-HIF-1α?EPC 組較Ad-GFP-EPC 組下肢壞死降低60％（N=10）。

11、組織學上可見移植28 d 后Ad-HIF-1α?EPC 較GFP 對照組進一步促進體內(nèi)毛細血管數(shù)目增加(P<0.05)，缺血面積減小(20±2％ vs. 26±3％,P<0.05); 功能學上Ad-HIF-1α?EPC 組幗窩局部皮溫回升、局部血流灌注增加。 結論：在體內(nèi)，Ad-HIF-1α轉染后的EPC 能促進EPC 在體內(nèi)對缺血部位修復的作用，從形態(tài)學、組織學、功能學等方面均證明其可促進缺血下肢的局部血管新生，為缺血性疾病

12、的治療提供實驗依據(jù)。 第四部分，Ad-HIF-1α-EPC 的靶向性作用及其機理研究。 目的：探討移植細胞經(jīng)全身循環(huán)后在體內(nèi)的定位；HIF-1α過表達對EPC 的靶向定位的影響及可能的機理。 方法：實時熒光檢測細胞移植后24 h 大體標本中Ad-GFP 在裸鼠體內(nèi)的定位；HLA 免疫組化測定外源性移植細胞在體內(nèi)的定位； 免疫組化測定BrdU 標記的外源性移植細胞在體內(nèi)的擴增；Real-timePCR

13、 法及ELISA 測定移植后缺血部位的趨化因子基質細胞衍生因子(Stromal derived factor, SDF)、CXCR4（SDF 受體）及VEGF 的表達。 結果：移植異種Ad-HIF-1α?EPC 至裸鼠缺血下肢24 h 后可見外源性EPC 聚集于缺血部位，HLA 檢測示人源的移植細胞定位并參與缺血區(qū)域的毛細血管新生，Ad-HIF-1α轉染后的EPC 增加移植細胞的成血管性；mRNA 檢測提示過表達HIF-1α基

14、因可上調(diào)其下游的SDF-1、CXCR4 因子(P<0.05)，增加EPC 招募，同時促VEGF 水平上調(diào)(P<0.05)。 結論：在體內(nèi)，移植的GFP-EPC 可聚集于缺血區(qū)域并參與局部血管新生，Ad-HIF-1α感染后的EPC 可進一步促進缺血下肢的局部血管新生, 這種EPC 數(shù)量的增加可能與SDF、CXCR4 的招募及VEGF的分泌增加有關。 結論： 本研究在通過密度梯度離心法分離得到人外周血單個核細胞，

15、在此基礎上定向誘導分化為EPC，通過電穿孔轉染或腺病毒感染的方法將HIF-1α轉入EPC，以期促進EPC 的擴增。研究發(fā)現(xiàn)：在體外通過腺病毒介導的HIF-1α有效的轉入EPC，在體外模擬體內(nèi)的低氧環(huán)境中HIF-1α不改變EPC 作為EC 前體細胞的特性，促EPC 向EC 分化；同時HIF-1α促EPC 加速擴增、刺激集落形成單位形成、在體外的遷移功能加強。在隨后的動物模型中，成功建立了裸鼠下肢缺血模型，在HIF-1α?EPC 經(jīng)尾靜脈移