體外雪旺細胞與血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)的實驗研究.pdf

1、目的:周圍神經(jīng)損傷后,缺損的替代修復是一直臨床關注的熱點,尚未得到完全解決。長期以來,自體神經(jīng)移植被公認為修復缺損周圍神經(jīng)的“金標準”。但由于可供移植的自體神經(jīng)有限,同時供區(qū)常常伴有不同程度的副損傷,而且容易造成供區(qū)感覺或運動功能障礙、創(chuàng)傷性神經(jīng)瘤形成、手術難度大以及軸突生長錯位等問題,因此,尋找一種理想的自體神經(jīng)的替代材料修復缺損的周圍神經(jīng)成為近年來周圍神經(jīng)研究領域的焦點。然而,到目前為止,組織工程神經(jīng)移植的效果還不是很理想,與自體神

2、經(jīng)移植的效果相比還有差距,如缺損的神經(jīng)過長或較粗大,或為肌腱、骨外露等血供不良的創(chuàng)面時,修復效果不好。是因為組織工程神經(jīng)移植區(qū)的再血管化延遲,在早期不能及時建立內(nèi)在有效的血液循環(huán),導致缺血缺氧,部分種子細胞死亡,神經(jīng)再生的質量降低。因此,找到解決人工神經(jīng)移植區(qū)血管化的有效方法是決定人工神經(jīng)移植成功的關鍵因素之一。
　　 雪旺細胞(Schwann cells,SCs)作為周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質細胞,是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細胞,具

3、有支持、保護、分隔、營養(yǎng)、趨化和促進再生的神經(jīng)纖維成熟等主要功能,同時能夠產(chǎn)生一些神經(jīng)營養(yǎng)因子,通過多種途徑作用于受損的周圍神經(jīng),進而促進損傷神經(jīng)功能的恢復,在周圍神經(jīng)損傷后的修復性再生過程中起著非常關鍵的作用。因而提高損傷局部雪旺細胞的增殖能力及數(shù)量能夠更好地促進受損周圍神經(jīng)的功能恢復。血管內(nèi)皮細胞(Vascular endothelia cells,VECs)為覆蓋在血管內(nèi)表面的單層扁平細胞,不僅是位于血液和血管壁之間的一個選擇性通

4、透屏障,而且是毛細血管重要組成部分。正常神經(jīng)組織內(nèi)血管較豐富,神經(jīng)內(nèi)膜內(nèi)分布有毛細血管網(wǎng),是神經(jīng)組織與營養(yǎng)物質的橋梁,并保證神經(jīng)纖維的生成和正常功能的發(fā)揮。
　　 本實驗目的是以雪旺細胞和血管內(nèi)皮細胞聯(lián)合培養(yǎng)為組織工程人工神經(jīng)血管的形成提供接近天然的條件,并進一步證明兩種細胞聯(lián)合培養(yǎng)能夠在血管形成的基礎上為雪旺細胞提供營養(yǎng)并促進其生長,同時找到兩種細胞共培養(yǎng)的最適比例,進而嘗試找到一種理想的促進組織工程人工神經(jīng)血管化的方法,為最

5、終實現(xiàn)組織工程人工神經(jīng)移植的臨床應用提供前期基礎理論及實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、胎兔雪旺細胞的原代及傳代培養(yǎng)取懷孕28天的新西蘭白兔,耳緣靜脈注入空氣處死,常規(guī)消毒、鋪無菌巾,迅速剖腹取胎兔,在無菌條件下取其坐骨神經(jīng),并去除神經(jīng)外膜及束膜,Hank's液沖洗5遍,剪碎,使用雙酶消化法獲取SCs,以雙30min差速貼壁法及培養(yǎng)過程中先加入Arab-C(終末濃度為10-5mmol/l)去除和抑制纖維母細胞,后換成含

6、NGF(40ng/ml)培養(yǎng)液促進SCs生長,每日在倒置顯微鏡下觀察,培養(yǎng)后的第2代SCs用S-100抗體免疫細胞化學染色鑒定并計算其濃度,待細胞長滿培養(yǎng)皿后可移除培養(yǎng)液,用胰酶消化后用細胞刮匙收集細胞于培養(yǎng)液中待用。
　　 2、胎兔血管內(nèi)皮細胞的原代及傳代培養(yǎng)以相同方法取出胎兔,在無菌條件下,取出胎兔胸主動脈,PBS反復沖洗管腔內(nèi)外,以傳統(tǒng)的酶消化法獲得VECs,在培養(yǎng)液中加入血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothe

7、liagrowth factor,VEGF)促進VECs增殖,每日在倒置顯微鏡下觀察,培養(yǎng)后的第2代VECs用FⅧRA抗體免疫細胞化學染色鑒定并計算其濃度,待細胞長滿培養(yǎng)皿后可移除培養(yǎng)液,用胰酶消化后用細胞刮匙收集細胞于培養(yǎng)液中待用。
　　 3、雪旺細胞和血管內(nèi)皮細胞直接共培養(yǎng)取傳至第3代的胎兔SCs和VECs,將SCs與VECs以1:1、2:1、4:1的比例聯(lián)合直接共培養(yǎng)于加入20％胎牛血清的DMEM及M199的混合培養(yǎng)基中,

8、設為實驗組A、B、C三組,同時將SCs單獨培養(yǎng)設為對照組D。在兩種細胞共培養(yǎng)的第1、3、5、7天時,進行SCs細胞計數(shù)并繪制其生長曲線,檢測VECs對SCs的影響。
　　 結果:
　　 1、雪旺細胞的培養(yǎng)結果觀察體外培養(yǎng)的SCs約第7天爬滿6cm培養(yǎng)皿。在倒置顯微鏡下觀察:SCs形態(tài)多為梭形,有突起,雙極,偶見三個細胞突起:細胞核明顯,呈卵圓形;細胞呈端對端、肩并肩、旋渦狀或柵欄狀排列生長,并用S-100抗體免疫細胞化學

9、染色證實為SCs;少量纖維母細胞呈“煎雞蛋”樣,胞體較雪旺細胞大,扁平狀,外形不規(guī)則,突起短而多,核仁明顯,約2到3個,顏色較雪旺細胞淺。
　　 2、血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)結果觀察每天在倒置顯微鏡下觀察VECs生長情況:VECs初為圓形或橢圓形,立體感和折光性較強,數(shù)目不等成堆聚集,多呈小團集落,6～8天完全匯合形成連續(xù)的單層細胞,融合成片后外觀呈特征性的“鵝卵石”樣形態(tài),排列致密,細胞質豐富;傳代VECs個體較小,為短梭形、方形或

10、多角形細胞,折光性小,細胞立體形態(tài)加強,鏡下形成“鋪路石”樣改變,并用FⅧRA免疫細胞化學染色證實為VECs。
　　 3、雪旺細胞與血管內(nèi)皮細胞直接共培養(yǎng)的結果觀察各組SCs數(shù)量隨培養(yǎng)時間的延長而增加,其中在共培養(yǎng)第1天,各實驗組與對照組細胞數(shù)量無差異(P＞0.05),從共培養(yǎng)第3天起至第7天,實驗組A(SCs與VECs比例為1:1)、C(SCs與VECs比例為4:1)細胞計數(shù)與對照組D有統(tǒng)計學差異(P＜0.05),實驗組B(S

11、Cs與VECs比例為2:1)與對照組D無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05),而與其他兩實驗A、C組有顯著差異(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1、在體外培養(yǎng)SCs過程中,使用雙差速貼壁法可以去除大部分纖維母細胞,在細胞培養(yǎng)初期使用Arab-C能抑制纖維母細胞生長,后期培養(yǎng)液中加入NGF可促進SCs生長,從而獲得大量的純度達90％以上的SCs。
　　 2、在體外培養(yǎng)VECs過程中,采用傳統(tǒng)的酶消化法獲取VECs,

12、在培養(yǎng)液中加入VEGF可以促進VECs增殖,不僅抑制VECs在缺氧狀態(tài)下的凋亡,還可有效抑制平滑肌細胞的生長,同時控制恰當?shù)哪z原酶消化的時間,從而獲得大量的純度達90％以上的VECs。
　　 3、胎兔胸主動脈來源的VECs能在體外促進胎兔SCs分化增殖;SCs與VECs的比例為2:1時,VECs促進SCs分化增殖的能力最強。
　　 4、SCs與VECs共培養(yǎng)可以作為促進組織工程人工神經(jīng)血管化的方法之一,為最終實現(xiàn)組織工程