bFGF促進(jìn)高糖抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.為了研究血管生成，我們建立了Ⅰ型糖尿病大鼠模型作為對象;
　　2.檢測bFGF是否對高糖抑制的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移具有緩解作用，及bFGF是否對高糖誘導(dǎo)的凋亡炎癥具有保護(hù)作用;
　　3.檢測高糖抑制的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移以及高糖誘導(dǎo)的凋亡是否通過激活bFGF調(diào)控的JNK和ERK信號實現(xiàn);
　　4.檢測ROS清除劑是否能減少高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的積累，并且促進(jìn)高糖抑制的血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移;
　

2、　方法：
　　1.在STZ注射八周后，在大鼠腰部進(jìn)行全層皮膚切除。HE染色顯示大鼠皮膚治療7天后的血管數(shù)量;
　　2.設(shè)置不同濃度bFGF作用不同時間，用CCK-8檢測細(xì)胞在高糖條件下的增殖情況，用Western-blot檢測細(xì)胞內(nèi)TNF-α和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)情況;
　　3.細(xì)胞劃痕實驗檢測分析bFGF，JNK和ERK抑制劑以及ROS清除劑對高糖損傷后的內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響，Western-

3、blot檢測高糖刺激后ERK和JNK的磷酸化水平;
　　4.用免疫熒光實驗分析高糖刺激后，bFGF，JNK和ERK抑制劑以及ROS清除劑對血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)active Caspase-3的活性改變;
　　5.用DCFH-DA檢測試劑盒分析高糖刺激后，給予bFGF，JNK和ERK抑制劑以及ROS清除劑對細(xì)胞內(nèi)ROS的水平改變;
　　結(jié)果：
　　1.糖尿病組中血管的密度明顯低于非糖尿病組，而給予bFGF治療的糖尿病組血

4、管數(shù)量又有所增多;
　　2.研究發(fā)現(xiàn)高糖明顯抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移，而bFGF促進(jìn)高糖損傷后的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而抑制了高糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥和凋亡因子(TNF-alpha/cleaved Caspase-3);
　　3.我們研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)高糖刺激后，JNK和ERK的磷酸化水平隨著時間持續(xù)地上調(diào)。而血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)bFGF刺激后，JNK的磷酸化短暫地升高了，ERK的磷酸化水平?jīng)]有太明顯的變化。此外，高糖誘導(dǎo)JN

5、K和ERK磷酸化水平升高后，再加入bFGF作用30 min，卻使JNK和ERK的磷酸化水平下降了;
　　4.劃痕實驗顯示，在低糖條件下，當(dāng)加入JNK和ERK抑制劑，細(xì)胞遷移受到抑制，相反的，對高糖損傷后的血管內(nèi)皮細(xì)胞給予JNK和ERK抑制劑時，受到高糖抑制的細(xì)胞遷移又有所恢復(fù);
　　5.我們發(fā)現(xiàn)高糖刺激的細(xì)胞積累了更多的ROS和active caspase-3。在高糖刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞72 h后，再加入JNK和ERK的抑制劑s

6、p600125和U0126作用1h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種抑制劑顯著的緩解了高糖誘導(dǎo)的ROS的過度產(chǎn)生和active caspase-3的異常激活。此外，高糖損傷后，當(dāng)加入ROS清除劑MnTmPyP，也減少了ROS的產(chǎn)生，并抑制了細(xì)胞的凋亡;
　　6.高糖明顯增加了細(xì)胞內(nèi)的ROS，而清除劑MnTmPyP顯著減少了高糖誘導(dǎo)積累的ROS。此外，受到高糖抑制的細(xì)胞遷移也得到了緩解;
　　結(jié)論：
　　傷口愈合中血管新生是極其重要的一個

7、過程，而我們研究得出bFGF保護(hù)了糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)口血管的生成障礙。
　　我們在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入了高濃度的葡糖糖來模擬糖尿病患者體內(nèi)高血糖的環(huán)境。
　　結(jié)果顯示bFGF緩解了高糖對血管內(nèi)皮細(xì)胞活性和遷移的損傷，bFGF在多種細(xì)胞中能夠激活多個下游信號分子，其中就包括促分裂原激活蛋白激酶家族(MAPKs)。
　　分子生物學(xué)實驗證明高糖通過MAPKs(JNK和ERK)通路抑制了細(xì)胞遷移。此外，高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡以及