PSGL-1過表達(dá)內(nèi)皮祖細(xì)胞移植促進(jìn)缺血組織血管新生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、下肢缺血性疾病多由動(dòng)脈粥樣硬化所致的動(dòng)脈狹窄或閉塞引起，其最早及最常見的癥狀為間歇性跛行，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)缺血性靜息痛、足趾缺血性潰瘍和壞疽，甚至導(dǎo)致截肢。隨著生活水平日益提高，下肢缺血性疾病的發(fā)病率亦逐年升高，嚴(yán)重的影響著人們的生活質(zhì)量。
　　 近年來，內(nèi)皮祖細(xì)胞移植促進(jìn)血管新生技術(shù)為患者治療嚴(yán)重下肢缺血性疾病提供了一種新途徑。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell，EPC）是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在

2、胚胎或成年后缺血、創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下參與血管的新生。但是近些年的研究發(fā)現(xiàn)，由于體內(nèi)病理生理環(huán)境的影響，注射入體內(nèi)的EPC只有很少一部分聚集到缺血部位發(fā)揮作用，因此，如何通過各種措施增加EPC歸巢的數(shù)量已經(jīng)成為目前研究的焦點(diǎn)。
　　 P選擇素糖蛋白配體-1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）是九十年代初發(fā)現(xiàn)的一種粘附分子，具有同源二聚體的結(jié)構(gòu)，是一種分子量為120KD的跨膜糖蛋白，表達(dá)于

3、多種白細(xì)胞的表面，如中性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等。PSGL-1與P選擇素的相互作用在介導(dǎo)細(xì)胞初始粘附過程中有重要作用。本研究試圖探討將PSGL-1轉(zhuǎn)染到EPC后觀察PSGL-1在EPC中的過表達(dá)是否有助于進(jìn)一步促進(jìn)EPC的血管新生作用，為EPC在促進(jìn)血管新生和治療缺血性疾病的臨床應(yīng)用方面提供新的研究線索。
　　 一、P選擇素糖蛋白配體-1重組腺病毒載體的構(gòu)建。將人P選擇素糖蛋白配體-1的cDNA亞克隆至穿梭質(zhì)粒pDC316，

4、用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)的骨架質(zhì)粒pBHGlox-E1，3Cre和穿梭質(zhì)粒pDC316-PSGL-1共轉(zhuǎn)染人HEK293細(xì)胞，進(jìn)行同源重組并包裝擴(kuò)增病毒。經(jīng)酶切鑒定及PCR結(jié)果證明PSGL-1基因重組腺病毒載體構(gòu)建成功，測序結(jié)果表明所的目的基因?yàn)镻SGL-1，用HEK293細(xì)胞包裝后，重組腺病毒的滴度為3.1x1011PFU/ml。在第一部分實(shí)驗(yàn)中成功應(yīng)用AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)成功地構(gòu)建了人P選擇素糖蛋白配體-1重組腺

5、病毒載體。
　　 二、腺病毒介導(dǎo)PSGL-1體外感染EPC的實(shí)驗(yàn)研究。在這一部分中我們體外原代培養(yǎng)大鼠骨髓EPC，并通過形態(tài)學(xué)和FITC-UEA-I和DiI-acLDL雙吞噬實(shí)驗(yàn)鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞，用攜帶PSGL-1基因的腺病毒真核載體（Ad-PSGL-1-CMV-GFP）轉(zhuǎn)染第七天的EPC，并設(shè)空白對(duì)照組，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后第2天綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)率。FITC-UEA-I和DiI-acLDL熒光雙染證實(shí)分化的EPCs，

6、以MOI為100感染各組細(xì)胞24h后，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率可達(dá)75％以上，未發(fā)現(xiàn)明顯的腺病毒感染引起的凋亡，RT-PCR和Western，免疫熒光可證實(shí)腺病毒介導(dǎo)的PSGL-1的基因和蛋白質(zhì)在EPC中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，PSGL-1過表達(dá)可增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)活化內(nèi)皮細(xì)胞的粘附性。通過腺病毒介導(dǎo)的方法基因修飾EPC初步認(rèn)為細(xì)胞損傷小，轉(zhuǎn)染效率高，體外PSGL-1感染EPC增加了EPC與受損傷內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，為進(jìn)一步在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

7、
　　 三、Ad-PSGL-1-EPC對(duì)裸鼠缺血下肢血管新生的影響。建立裸鼠下肢缺血模型，術(shù)后48小時(shí)觀察造模足否成功；在體外通過腺病毒感染的方法介導(dǎo)人PSGL-1基因（Ad-PSGL-1）入EPC，經(jīng)尾靜脈將Ad-PSGL-1-EPC注入下肢缺血的裸鼠；14天后通過CD31免疫組織化學(xué)的方法計(jì)算毛細(xì)血管形成的數(shù)目；激光多普勒測定下肢血流的恢復(fù)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)裸鼠左下肢股動(dòng)脈部分結(jié)扎切除術(shù)后48小時(shí)造成下肢缺血，經(jīng)尾靜脈移植異種A