脂肪干細(xì)胞經(jīng)上調(diào)HIF-1α改善糖尿病缺血皮瓣新生血管形成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　探討人脂肪干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells, ASCs）局部移植對糖尿病缺血皮瓣成活的作用，并基于HIF-1α/VEGF通路探討ASCs對糖尿病缺血皮瓣新生血管形成的作用及其細(xì)胞和分子機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分：20只BALB/c-nu/nu雄性裸小鼠20只，隨機(jī)分為2組，其中10只為糖尿病組（擬制備糖尿病動(dòng)物模型），另10只為非糖尿病對照組（非糖尿病組）。首先對實(shí)驗(yàn)組小鼠

2、采用單劑量腹腔注射鏈脲佐菌素法誘導(dǎo)糖尿病動(dòng)物模型，選取達(dá)到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)者入選。于兩組裸小鼠背部設(shè)計(jì)蒂在尾側(cè)的隨意型皮瓣，皮瓣下放置硅膠膜片以阻止基底血供，原位縫合。術(shù)后觀察皮瓣的成活情況，并用數(shù)碼相機(jī)拍照錄入圖像分析軟件并分析成活面積百分比。分別于術(shù)后第1，2，7天，通過微循環(huán)激光多普勒血流儀分別測量皮瓣微循環(huán)血流灌注情況。
　　第二部分：65只BALB/c-nu/nu小鼠，采用STZ單劑量腹腔注射法誘導(dǎo)I型糖尿病裸小鼠動(dòng)物模型

3、。選取45只糖尿病裸小鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法將45只誘導(dǎo)成模裸鼠隨機(jī)分為3組，即實(shí)驗(yàn)組（ASCs移植組）、細(xì)胞懸液對照組（PBS注射組）和空白對照組，每組各15只。收集吸脂術(shù)后人脂肪組織，分離、培養(yǎng)ASCs，并通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD29、CD44、CD105、CD34、CD45以及CD31。移植前，將待移植的ASCs采用DiI標(biāo)記。于3組糖尿病裸小鼠背部制備蒂在尾側(cè)的缺血皮瓣，具體方法同前。實(shí)驗(yàn)組，提起皮瓣后，將經(jīng)DiI標(biāo)

4、記好的ASCs的PBS細(xì)胞懸液注射于皮瓣內(nèi)，細(xì)胞懸液對照組則注射等量的PBS，而空白對照組皮瓣不予任何干預(yù)。于術(shù)后第24小時(shí)，各組隨機(jī)抽取3只，采集皮瓣相同部位部分皮瓣組織用于通過免疫印跡法測定HIF-1α以及VEGF蛋白表達(dá)量。于術(shù)后第七天，對其余糖尿病小鼠皮瓣皮瓣進(jìn)行大體觀察成活情況，數(shù)碼拍照結(jié)合圖像分析軟件計(jì)算成活面積百分比，通過激光多普勒血流測定儀測定皮瓣成活壞死交界部位微循環(huán)血流灌注情況，通過組織學(xué)分析（HE、免疫熒光等）皮瓣

5、微血管密度（Microvessel density，MVD）以及CD31陽性細(xì)胞（血管內(nèi)皮細(xì)胞）密度情況，通過免疫熒光技術(shù)檢測ASCs在皮瓣內(nèi)的轉(zhuǎn)歸以及與微血管位置關(guān)系。
　　第三部分：收集脂肪抽吸術(shù)后人脂肪組織，培養(yǎng)ASCs，具體方法同前。將第3～4代的ASCs分為四組，每組設(shè)2組重復(fù)，分別給予不同的培養(yǎng)環(huán)境，即高糖（25mM D-葡萄糖）低氧（0.5％O2）、高糖正常氧（21%O2）、低糖（5 mM D-葡萄糖）低氧、低糖正常

6、氧分壓組培養(yǎng)。通過Hoechst33258 DNA定量法測定細(xì)胞數(shù)量，繪制生長曲線。通過細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn)，測定不同環(huán)境對細(xì)胞遷移有無影響，通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測VEGF表達(dá)情況，通過免疫印跡法檢測ASCs的HIF-1α情況。采集糖尿病裸小鼠皮膚組織，體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增糖尿病裸小鼠真皮來源成纖維細(xì)胞（Dermal fibroblasts，F(xiàn)bs），收集第3～4代Fbs用于實(shí)驗(yàn)。采用Transwell共培養(yǎng)體系，將Fbs與A

7、SCs共培養(yǎng)體系分為兩組，高糖低氧組和高糖正常氧分壓組。將共培養(yǎng)體系于高糖正常氧分壓培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)48h后，模擬糖尿病裸小鼠缺血皮瓣高糖（25mM D-葡萄糖）低氧低氧（0.5% O2）以及非缺血組織高糖正常氧分壓兩種環(huán)境培養(yǎng)12h。收獲生長于培養(yǎng)皿底部的糖尿病小鼠 Fbs，提取蛋白用于免疫印跡檢測VEGF和HIF-1α。
　　結(jié)果：
　　糖尿病組10只裸小鼠經(jīng)單劑量腹腔注射鏈脲佐菌素，成模8只入選實(shí)驗(yàn)，2只棄用（其中1只死

8、亡，1只血糖未達(dá)到糖尿病模型診斷標(biāo)準(zhǔn)）。在非糖尿病組，3例皮瓣完全成活，7例皮瓣遠(yuǎn)端出現(xiàn)了少量壞死，皮瓣成活面積為98.3±6.5%。在糖尿病組，8例皮瓣均出現(xiàn)了不同程度的壞死，皮瓣成活面積為46.0±8.5%，與非糖尿病皮瓣相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P＜0.01）。ASCs組皮瓣成活面積較對照組成活面積顯著提高（P＜0.05），皮瓣內(nèi)有較多的血流灌注（P＜0.05）。與對照組比，ASCs組皮瓣毛細(xì)血管密度較高（P＜0.05），血管內(nèi)皮細(xì)胞

9、數(shù)較多（P＜0.05），皮瓣組織HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)較高。ASCs在不同糖濃度（普通糖濃度、高糖濃度）、不同氧分壓培養(yǎng)環(huán)境下其保持較好的細(xì)胞生物學(xué)行為；低氧環(huán)境下能夠合成一定濃度的HIF-1α，表達(dá)較高濃度的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子。體內(nèi)糖尿病裸小鼠背部隨意型皮瓣動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：ASCs可以通過提高皮瓣局部血流、增加局部毛細(xì)血管密度、提高局部血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量、提高局部HIF-1α和VEGF的表達(dá)改善糖尿病裸小鼠皮瓣的成活。
　

10、　結(jié)論：
　　新生血管生成障礙，微血管密度較低，微循環(huán)血流灌注較差是糖尿病缺血皮瓣成活障礙的主要原因之一。ASCs糖尿病缺血皮瓣局部移植可以通過上調(diào)HIF-1α/VEGF通路蛋白水平，促進(jìn)糖尿病缺血皮瓣新生血管形成，從而增加糖尿病缺血皮瓣微循環(huán)血流灌注，進(jìn)而改善糖尿病缺血皮瓣的成活。ASCs在不同環(huán)境（高糖普通氧分壓、高糖低氧分壓、低糖普通氧分壓、低糖低氧分壓）下均保持較好的干細(xì)胞特性。其可以通過旁分泌以及細(xì)胞-細(xì)胞交互作用改善糖