大鼠肥大細(xì)胞對心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管新生功能的體外研究.pdf

1、肥大細(xì)胞(Mastcells，MCs)來源于骨髓多能干細(xì)胞，在外周循環(huán)中以少量的前體細(xì)胞形式存在，在MCs發(fā)育為成熟細(xì)胞前這些前體細(xì)胞可以表達(dá)Fc-ε-RⅠ和Fc-γ-RⅡ/Ⅲ，在干細(xì)胞趨化因子(stemcellfactor，SCF)作用下遷移到不同的組織并轉(zhuǎn)變成為成熟的MCs。MCs是一種重要的免疫細(xì)胞，既往對MCs的研究主要集中于其在Ⅰ型超敏反應(yīng)中的作用，但是進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)MCs在自身免疫性疾病、外周耐受、先天性免疫適應(yīng)中也發(fā)揮了

2、重要的作用。近來的研究顯示心臟組織中也存在MCs，活化的M℃s與動脈粥樣硬化、心肌缺血、心臟移植后的纖維化、高血壓、心肌病等多種心血管疾病有關(guān)。MCs多位于新生血管周圍，研究已經(jīng)證實MCs參于血管新生有關(guān)，在腫瘤的研究中顯示腫瘤的惡性程度是與腫瘤新生血管富于侵蝕性有關(guān)的，而這些新生血管與MCs細(xì)胞數(shù)目是存在一定的關(guān)系。近期研究還發(fā)現(xiàn)MCs與肥胖或糖尿病有關(guān)，這也與MCs參與血管新生的過程有關(guān)。MCs可以產(chǎn)生、存儲和釋放多種血管新生物質(zhì)，

3、如:組胺、肝磷脂蛋白聚糖、類胰蛋白酶、類糜蛋白酶、多種生長因子和細(xì)胞活素類物質(zhì)，這些物質(zhì)在不同程度上參與了血管新生的過程。雖然體外和體內(nèi)多項研究顯示MCs是與血管新生有關(guān)的，但這些新生血管多表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)和功能的異常，而且這些血管易于出血和富于侵蝕性，這表明MCs可能與這些新生血管的功能障礙有關(guān)。雖然研究顯示MCs分泌的多種物質(zhì)參與血管新生的過程，但是類胰蛋白酶和類糜蛋白酶作為MCs的主要物質(zhì)在血管新生過程中哪一個占主導(dǎo)作用未見相關(guān)報道。微

4、血管內(nèi)皮細(xì)胞(microvascularendothelialcells，MVECs)不僅是血管內(nèi)的一層屏障，還具有活躍的合成細(xì)胞因子和各種活性物質(zhì)參與機(jī)體多種生理功能調(diào)節(jié)的重要作用。研究顯示血管新生過程是與MMVECs的增殖、遷移等過程密切相關(guān)的，因此MMVECs功能變化一直是血管新生的重點研究領(lǐng)域。本研究主要從MCs的主要兩種物質(zhì)類胰蛋白酶和類糜蛋白酶著手研究活化的MCs對各種情況下MVECs血管新生的影響。
　　本研究采用W

5、istar大鼠的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(myocardialmicrovascularendothelialcells，MMVECs)和腹腔MCs在不同條件下共培養(yǎng)的方法，在體外比較MMVECs新生功能的改變。已有研究結(jié)果表明，促血管新生因子以及受體的異常表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙是血管新生異常的重要原因。根據(jù)促血管新生因子和抑制因子平衡的理論，本研究從促血管新生的角度出發(fā)，比較MCs活化后對MMVECs上促血管新生因子和受體的表達(dá)變化，研究MCs

6、對MMVECs血管新生的影響。實驗主要分以下三部分:
　　第一部分:分別取80-100g和250gWistar大鼠采用植塊法和梯度離心法培養(yǎng)MMVECs和MCs。通過CD31、CD34、Ⅷ因子和細(xì)胞形態(tài)鑒定MMVECs，通過甲苯胺藍(lán)染色鑒定MCs。將MMVECs和活化后的MCs產(chǎn)物——MCGs進(jìn)行共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)MCGs可以促進(jìn)MMVECs細(xì)胞的增殖、遷移，而使用類胰蛋白酶抑制劑—TLCK和類糜蛋白酶—TPCK后這方面作用被削弱，而TL

7、CK的抑制作用尤其明顯。對Ang/Tie-2系統(tǒng)的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MCGs可以促進(jìn)Ang-1mRNA表達(dá)而抑制Ang-2表達(dá)，對Tie-2則沒有明顯影響，但是我們并沒有發(fā)現(xiàn)MMVECs表達(dá)Ang-1蛋白，而在MCGs作用下Ang-2表達(dá)降低，這樣的作用可以被相關(guān)抑制劑逆轉(zhuǎn)，而在TLCK中的作用尤其明顯，我們研究顯示類胰蛋白酶是MCs中主要的促血管新生物質(zhì)，MCGs參與的新生血管的不成熟是與Ang-2/Tie-2系統(tǒng)失衡有關(guān)的。
　　

8、第二部分:通過在不同糖濃度下MMVECs與MCGs共培養(yǎng)觀察觀察高血糖及MCGs單獨存在及這兩者共存時對MMVEC的血管新生能力的影響。探討高糖情況下VEGF及受體表達(dá)的改變和Ang/Tie-2信號通路的改變。利用實時定量RT-PCR、Westernblot方法觀察不同糖濃度下及MCGs存在時對MMVEC中VEGF、Flt-1、Flk-1、Ang-1、Ang-2和Tie-2mRNA及蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)。結(jié)果顯示與低糖濃度下的MMVECs相比

9、，雖然高糖環(huán)境下MMVEC中VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)增加，但是由于其受體Flt-1、Flk-1mRNA及蛋白和Ang-1mRNA表達(dá)的下調(diào)，高糖濃度下血管新生的能力還是下降的。MCGs促進(jìn)VEGF及相關(guān)受體、促進(jìn)Ang-1mRNA表達(dá)，抑制Ang-2mRNA和蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)血管新生。使用類胰蛋白酶抑制劑—TLCK抑制了血管新生的相關(guān)改變，而類糜蛋白酶抑制劑—TPCK雖然也可以抑制血管新生，但是其作用是顯著弱于TLCK的，對高糖

10、情況下的作用尤為明顯。
　　第三部分:缺血缺氧環(huán)境下存在MCs自發(fā)性脫顆粒，為進(jìn)一步探討低氧環(huán)境下MCs對MMVECs血管新生功能的影響，本部分對MCs及MMVECs在OGD條件下細(xì)胞損傷功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)MCs在第2小時起即可出現(xiàn)自發(fā)性脫顆粒現(xiàn)象，隨著OGD時間的延長，活化的MCs數(shù)目在增多，MCs膜穩(wěn)定劑—色甘酸鈉(DSCG)可以穩(wěn)定MCs膜結(jié)構(gòu)減輕MCs的脫顆粒程度。MMVECs在第16小時起出現(xiàn)自身細(xì)胞的損傷。隨著OGD

11、的進(jìn)展，VEGF和Ang-1的mRNA在第8小時達(dá)到峰值，自第16小時起VEGF及Ang-1mRNA表達(dá)呈顯著的下降，VEGF的相關(guān)受體Flt-1和Flk-1mRNA自第2小時起即出現(xiàn)逐步下降趨勢，而Ang-2mRNA表達(dá)隨OGD的進(jìn)展表達(dá)呈逐步增加的趨勢，我們發(fā)現(xiàn)MCs和MCGs可以增加VEGF及其受體的表達(dá)，抑制Ang-2的表達(dá)，這在MCGs中尤為明顯，這與MCGs的有較高的類胰蛋白酶和類糜蛋白酶濃度有關(guān)。但是隨著OGD時間的延長血

12、管新生能力還是下降的，主要與OGD對MMVECs的作用有關(guān)。
　　結(jié)論:肥大細(xì)胞可以促進(jìn)MMVECs的血管新生，其主要與VEGF及相關(guān)受體表達(dá)上調(diào)及Ang-2表達(dá)降低有關(guān)。在高糖濃度下雖然存在活化的MCs，其血管新生能力還是弱于在低糖濃度下的MMVECs，VEGF在高糖濃度下表達(dá)增加但是由于其受體的下調(diào)，故其血管新生的能力還是下降的，這說明高糖對血管新生的影響是大于MCGs對MMVECs血管新生的影響的。在OGD情況下存在MCs的