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文檔簡(jiǎn)介
1、肝細(xì)胞癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。全世界45%的原發(fā)性肝癌發(fā)生在我國(guó),位列我國(guó)癌癥患者死亡原因第二位。其惡性程度很高,極易發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移,手術(shù)切除率低,手術(shù)療效較差。即使是小肝癌(<5cm)行根治術(shù)或肝臟移植術(shù)后,3年內(nèi)復(fù)發(fā)率也高達(dá)50%以上。肝癌的治療方法很多,包括早期切除、二期切除、經(jīng)肝動(dòng)脈栓塞化療術(shù)(TACE)、局部消融(微波、射頻等)及適形放療、生物治療、中藥等綜合治療。目前經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(TACE)治療肝癌已成為肝癌非手術(shù)治療的
2、首選方法,但其遠(yuǎn)期療效仍欠理想,術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移發(fā)生率較大。如何提高TACE遠(yuǎn)期療效,防止腫瘤進(jìn)展,延長(zhǎng)患者生存期是當(dāng)前的主要研究目標(biāo)。
目前研究證實(shí)導(dǎo)致TACE遠(yuǎn)期效果不理想的原因有:腫瘤壞死不徹底,血管新生,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。研究表明在腫瘤對(duì)缺氧缺血反應(yīng)中,HIF-1及VEGF發(fā)揮著重要的作用。
缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是缺氧條件下廣泛存在于人體的一種轉(zhuǎn)錄因子,其可激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)靶蛋白的生成并
3、發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,引起細(xì)胞對(duì)缺氧的一系列適應(yīng)性反應(yīng)如使細(xì)胞無(wú)氧酵解加強(qiáng),促進(jìn)腫瘤血管的新生并引起腫瘤自身的侵襲性增加和對(duì)放化療的抗拒性增加。HIF-1作為轉(zhuǎn)錄因子,其靶基因有60余種,主要有血紅素加氧酶和糖酵解酶等、VEGF、EPO、P53和血小板衍生生長(zhǎng)因子β(PDGF-β)等。HIF-1由α亞基和β亞基組成,HIF-1的生理活性是由HIF-1α亞基的活性和表達(dá)決定的。
由此可見(jiàn),HIF-1α在肝癌TACE術(shù)后殘留、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移
4、中發(fā)揮重要的作用,在分子水平沉默HIF-1α表達(dá)對(duì)提高TACE治療肝癌的療效具有極大的應(yīng)用前景。
RNAi(RNA interference)是現(xiàn)階段最新的基因技術(shù),它是指通過(guò)人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA),從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA降解,達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。
目前的研究可以推斷TACE聯(lián)合RNAi技術(shù)抑制HIF-1α基因表達(dá)將為肝癌的
5、綜合治療帶來(lái)嶄新的研究方向。
大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株來(lái)源于用二乙基亞硝胺(DENA)誘發(fā)的大鼠原發(fā)性肝癌,可分泌AFP,病理學(xué)上為肝細(xì)胞性肝癌,具有與肝細(xì)胞性肝癌相同的生物學(xué)特性。制作成功的大鼠肝癌模型,經(jīng)體表超聲檢查可發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)有腫塊存在,并且可進(jìn)行介入操作,為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作提供一個(gè)好的平臺(tái)。
本課題研究利用CoCl2誘導(dǎo)大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株模擬TACE術(shù)后缺氧環(huán)境,并在模擬缺氧環(huán)境下利
6、用HIF-1αsiRNA敲除HIF-1α基因從而抑制大鼠肝癌細(xì)胞模擬缺氧條件下HIF-1α及VEGF的表達(dá),為下一步活體實(shí)驗(yàn)提供體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),為肝癌的綜合治療提供一種新的手段。
第一部分
目的:觀(guān)察在不同濃度的CoCl2作用下大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株HIF-1α及VEGF在轉(zhuǎn)錄水平上各組表達(dá)的變化,建立理想的大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株體外模擬缺氧模型,探討模擬缺氧條件下HIF-1α與VEGF基因
7、表達(dá)的相關(guān)性。
方法:本部分采用CoCl2建立模擬缺氧模型。
1、檢測(cè)大鼠肝癌細(xì)胞株CBRH-7919細(xì)胞株模擬缺氧模型中CoCl2合適藥物濃度。
2、 MTT實(shí)驗(yàn)?zāi)M缺氧條件下不同濃度CoCl2對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的影響。
3、 realtime RT-PCR檢測(cè)HIF-1α,VEGF的mRNA在模擬缺氧條件下不同時(shí)段大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株中的表達(dá)水平。
8、 結(jié)果:
1、模擬缺氧12h條件下濃度為100μmol/L的CoCl2對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞株CBRH-7919細(xì)胞株存活及生長(zhǎng)無(wú)影響;濃度為150μmol/L,200μmol/L及300μmol/L,的CoCl2對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞株CBRH-7919細(xì)胞株存活及生長(zhǎng)有輕度抑制作用。模擬缺氧24h條件下濃度為100μmol/L及150μmol/L的CoCl2對(duì)大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株存活及生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用;濃度為200μm
9、ol/L及300μmol/L的CoCl2對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞株CBRH-7919細(xì)胞株存活及生長(zhǎng)有明顯抑制作用。
2、 realtime RT-PCR檢測(cè)模擬缺氧條件下HIF-1α,VEGF的mRNA的表達(dá)情況。模擬缺氧24h,在不同濃度CoCl2作用下,HIF-1α,VEGF表達(dá)上調(diào),以CoCl2濃度為200μmol/L上調(diào)最高,其次是濃度為150μmol/L組。
3、分析正常組與模擬缺氧組之間HIF-1α,VE
10、GFmRNA表達(dá)的相關(guān)性,r=0.982,P<0.05。
結(jié)論:
1、利用濃度為150μmol/L的CoCl2孵育24h制作的大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株模擬缺氧模型對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)影響無(wú)明顯抑制作用,且HIF-1α,VEGF上調(diào)明顯,能成功建立理想的體外大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株模擬缺氧模型。
2、模擬缺氧條件下大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株HIF-1α,VEGF表達(dá)明顯上調(diào),
11、且兩者之間呈正相關(guān)關(guān)系。
第二部分
目的:研究HIF-1αsiRNA對(duì)模擬缺氧狀態(tài)下大鼠肝癌細(xì)胞HIF-1α及VEGF表達(dá)的影響,為HIF-1α基因干擾應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。
方法:本部分采用CoCl2建立模擬缺氧模型。
1、根據(jù)HIF-1α基因序列設(shè)計(jì)三對(duì)HIF-1αsiRNA、一對(duì)陰性對(duì)照siRNA及一對(duì)陽(yáng)性對(duì)照siRNA。
2、利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體把FAM-siR
12、NA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞,確保轉(zhuǎn)染效率大于90%。
3、利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體把HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞,模擬缺氧孵育24h后,realtime RT-PCR檢測(cè)HIF-1α,VEGF的mRNA表達(dá)的變化。
結(jié)果:
1、在細(xì)胞匯合度為30%-50%情況下轉(zhuǎn)染,siRNA的轉(zhuǎn)染效率為90%-95%。
2、 realtime RT-PCR檢測(cè)模擬缺氧條件下,轉(zhuǎn)染siRNA入大鼠肝癌CBRH-7
13、919細(xì)胞株后HIF-1α,VEGFmRNA表達(dá)情況,HIF-1αmRNA表達(dá)下降75%-80%,VEGFmRNA表達(dá)下降70%-75%。
結(jié)論:
1、模擬缺氧條件下轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA后,大鼠肝癌CBRH-7919細(xì)胞株HIF-1α,VEGFmRNA表達(dá)明顯受抑制。HIF-1αsiRNA序列1是干擾效果明顯的小干擾RNA。
2、篩選出一對(duì)能高效抑制HIF-1α表達(dá)的siRNA序列,為下一
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