HIF-1α促進內皮祖細胞血管新生的實驗研究.pdf

1、內皮祖細胞(endothelial progenitor cell,EPC)是血管內皮細胞的前體細胞,在胚胎或成年后缺血、創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下參與血管的新生.1997年Asatlara等在Science上發(fā)表的文章提出:人外周血中分離得到的EPC在體外培養(yǎng)可分化為內皮細胞并表達內皮特異性成分,在裸鼠下肢缺血模型中EPC可參與新生血管的形成,這一發(fā)現為缺血性疾病提供了新的輔助治療手段,此后,國際上對于外周血EPC移植促血管新生的研究始終方興未

2、艾.但是由于循環(huán)血中EPC數量不足,限制了EPC的廣泛應用.因此,如何通過各種措施增加EPC數量已經成為目前研究的焦點.低氧誘導因子一1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是在低氧環(huán)境中起細胞調控作用的關鍵基因,在缺血造成的低氧中發(fā)揮重要作用,但HIF-1α與干細胞尤其是EPC的關系尚不清楚.本研究試圖探討HIF-1α轉染到EPC后的變化,HIF-1α在EPC中的過表達是否有助于進一步促進EPC的血

3、管新生作用,為EPC在促進血管新生和治療缺血性疾病的臨床應用方面提供理論基礎和新的實驗依據. 第一部分HIF-1α轉染EPC的初步探討 [目的]建立人外周血內皮祖細胞(EPC)體外培養(yǎng)、誘導分化方法,觀察電穿孔轉染HIF-1α至EPC后,EPC在體外向內皮細胞(endothelial cell,EC)分化的性質、擴增及遷移功能改變及對體內缺血下肢血管新生的影響. [方法]密度梯度離心法分離獲得人外周血單個核細胞

4、,體外通過血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、成纖維細胞生長因子誘導、分化、擴增EPC并鑒定.分子生物學技術構建HIF-1α特異性干擾質粒(siHIF-1α),電穿孔技術轉染HIF-1α或其干擾質粒,觀察基因修飾的EPC形態(tài)學及功能學改變. [結果]體外培養(yǎng)所的EPC 7天后CD34+約30﹪,AC133+約10﹪,CD31+約33﹪,細胞保持EC前體細胞特性并可定

5、向向EC分化;EPC內的HIF-1αmRNA在常氧及低氧下有表達,但其蛋白表達在常氧中不穩(wěn)定.電穿孔轉染GFP空質粒的轉染效率約25﹪,低氧環(huán)境中轉染HIF-1α后的EPC中HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白表達升高,可被特異性siHIF-1α中度抑制;功能學檢測示HIF-1α過表達增加了EPC在體外的分化、擴增、遷移;EC標記物CD31、VEGFR2、eNOS及VEGF、NO分泌增加;移植HIF-1α-EPC至缺血下肢后可見外源性

6、EPC存在于缺血部位;HIF-1α-EPC較對照組進一步促進體內毛細血管數目增加. [結論]在體外,HIF-1α修飾的EPC不影響其前體細胞性質,可促進EPC擴增及遷移功能改善;在體內,HIF-1α-EPC有助于促進缺血下肢的局部血管新生. 第二部分腺病毒介導HIF-1α體外感染EPC的實驗研究 [目的] 改進轉染方法,通過腺病毒介導HIF-1α至EPC,提高了感染效率,觀察腺病毒介導的HIE-1α在EPC中的過

7、表達是否在體外有利于促進EPC的成血管活性. [方法] 在體外構建人 HIF-1α基因腺病毒載體(Ad-HIF-1α)及其siRNA抑制載體(Ad-si HIE-1α);通過腺病毒介導人 HIF-1α基因(Ad-HIF-1α)入EPC,觀察感染后EPC在體外的擴增及遷移功能改變. [結果] 以MOI為70感染各組細胞6 h后,熒光顯微鏡觀察轉染效率80﹪以上并持續(xù)至少1月,未發(fā)現明顯的腺病毒感染引起的凋亡;感染Ad-HI

8、F-1α后的EPC在體外細胞擴增數成倍增加,遷移功能改善(P<0.05),感染Ad-siHIF-1α后的EPC擴增及遷移功能受抑制. [結論] 在體外,通過腺病毒介導的方法基因修飾EPC初步認為高效,細胞損傷小,體外Ad-HIF-1α感染EPC增加了EPC的成血管活性,為進一步在體內實驗奠定了基礎. 第三部分 Ad-HIF-1α-EPC對裸鼠缺血下肢血管新生的影響 [目的] 觀察腺病毒介導的HIF-1α在EPC中

9、的過表達在體內是否有利于促進下肢局部缺血的恢復. [方法] 實驗性下肢缺血的裸鼠造模,術后7天觀察造模是否成功;在體外通過腺病毒感染的方法介導人HIF-1α基因(Ad-HIF-1α)入EPC,經尾靜脈將Ad-HIF-1α-EPC注入實驗性下肢缺血的裸鼠;基因及蛋白水平觀察HIF-1α的轉入;28天后大體標本觀察缺血下肢的恢復情況;毛細血管計數;TTC法觀察缺血面積;局部溫度測定及下肢多普勒血流測定. [結果]裸鼠左下肢股

10、動脈部分結扎切除術后7天造成下肢缺血,經尾靜脈移植異種Ad-HIF-1α-EPC至裸鼠鼠缺血下肢后28天Ad-GFP-EPC組及Ad.-HIF-1αEPC組均未發(fā)現下肢自體離斷,Ad-HIF-1α-EPC組較Ad-GFP-EPC組下肢壞死降低60﹪(N=10).組織學上可見移植28 d后Ad-HIF-1α-EPC較GFP對照組進一步促進體內毛細血管數目增加(P<0.05),缺血面積減小(20±2﹪vs.26±3﹪,P<0.05);功能學

11、上Ad-HIF-10c-EPC組幗窩局部皮溫回升、局部血流灌注增加. [結論]在體內,Ad-HIF-1α儀轉染后的EPC能促進EPC在體內對缺血部位修復的作用,從形態(tài)學、組織學、功能學等方面均證明其可促進缺血下肢的局部血管新生,為缺血性疾病的治療提供實驗依據. 第四部分Ad-HIF-1α-EPC的靶向性作用及其機理研究 [目的]探討移植細胞經全身循環(huán)后在體內的定位;HIE-1α過表達對EPC的靶向定位的影響及可能

12、的機理. [方法]實時熒光檢測細胞移植后24 h大體標本中Ad-GFP在裸鼠體內的定位;HIA免疫組化測定外源性移植細胞在體內的定位;免疫組化測定BrdU標記的外源性移植細胞在體內的擴增;Real-timePCR法及EUSA測定移植后缺血部位的趨化因子基質細胞衍生因子(Stromal deftved factor,SDF)、CXCR4(SDF受體)及VEGF的表達. [結果]移植異種Ad-HIF-1αEPC至裸鼠缺血下肢

13、24h后可見外源性EPC聚集于缺血部位,HIA檢測示人源的移植細胞定位并參與缺血區(qū)域的毛細血管新生,Ad-HIF-1α轉染后的EPC增加移植細胞的成血管性;mRNA檢測提示過表達HIF-1α基因可上調其下游的SDF-1、CXCR4因子(P<0.05),增加EPC招募,同時促VEGF水平上調(P<0.05). [結論]在體內,移植的GFP-EPC可聚集于缺血區(qū)域并參與局部血管新生,Ad-HIF-1α感染后的EPC可進一步促進缺血下