HIF-1α促進內(nèi)皮祖細(xì)胞血管新生的實驗研究.pdf

1、內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell,EPC)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,在胚胎或成年后缺血、創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下參與血管的新生.1997年Asatlara等在Science上發(fā)表的文章提出:人外周血中分離得到的EPC在體外培養(yǎng)可分化為內(nèi)皮細(xì)胞并表達內(nèi)皮特異性成分,在裸鼠下肢缺血模型中EPC可參與新生血管的形成,這一發(fā)現(xiàn)為缺血性疾病提供了新的輔助治療手段,此后,國際上對于外周血EPC移植促血管新生的研究始終方興未

2、艾.但是由于循環(huán)血中EPC數(shù)量不足,限制了EPC的廣泛應(yīng)用.因此,如何通過各種措施增加EPC數(shù)量已經(jīng)成為目前研究的焦點.低氧誘導(dǎo)因子一1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是在低氧環(huán)境中起細(xì)胞調(diào)控作用的關(guān)鍵基因,在缺血造成的低氧中發(fā)揮重要作用,但HIF-1α與干細(xì)胞尤其是EPC的關(guān)系尚不清楚.本研究試圖探討HIF-1α轉(zhuǎn)染到EPC后的變化,HIF-1α在EPC中的過表達是否有助于進一步促進EPC的血

3、管新生作用,為EPC在促進血管新生和治療缺血性疾病的臨床應(yīng)用方面提供理論基礎(chǔ)和新的實驗依據(jù). 第一部分HIF-1α轉(zhuǎn)染EPC的初步探討 [目的]建立人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化方法,觀察電穿孔轉(zhuǎn)染HIF-1α至EPC后,EPC在體外向內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell,EC)分化的性質(zhì)、擴增及遷移功能改變及對體內(nèi)缺血下肢血管新生的影響. [方法]密度梯度離心法分離獲得人外周血單個核細(xì)胞

4、,體外通過血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)、分化、擴增EPC并鑒定.分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建HIF-1α特異性干擾質(zhì)粒(siHIF-1α),電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)染HIF-1α或其干擾質(zhì)粒,觀察基因修飾的EPC形態(tài)學(xué)及功能學(xué)改變. [結(jié)果]體外培養(yǎng)所的EPC 7天后CD34+約30﹪,AC133+約10﹪,CD31+約33﹪,細(xì)胞保持EC前體細(xì)胞特性并可定

5、向向EC分化;EPC內(nèi)的HIF-1αmRNA在常氧及低氧下有表達,但其蛋白表達在常氧中不穩(wěn)定.電穿孔轉(zhuǎn)染GFP空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率約25﹪,低氧環(huán)境中轉(zhuǎn)染HIF-1α后的EPC中HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白表達升高,可被特異性siHIF-1α中度抑制;功能學(xué)檢測示HIF-1α過表達增加了EPC在體外的分化、擴增、遷移;EC標(biāo)記物CD31、VEGFR2、eNOS及VEGF、NO分泌增加;移植HIF-1α-EPC至缺血下肢后可見外源性

6、EPC存在于缺血部位;HIF-1α-EPC較對照組進一步促進體內(nèi)毛細(xì)血管數(shù)目增加. [結(jié)論]在體外,HIF-1α修飾的EPC不影響其前體細(xì)胞性質(zhì),可促進EPC擴增及遷移功能改善;在體內(nèi),HIF-1α-EPC有助于促進缺血下肢的局部血管新生. 第二部分腺病毒介導(dǎo)HIF-1α體外感染EPC的實驗研究 [目的] 改進轉(zhuǎn)染方法,通過腺病毒介導(dǎo)HIF-1α至EPC,提高了感染效率,觀察腺病毒介導(dǎo)的HIE-1α在EPC中的過

7、表達是否在體外有利于促進EPC的成血管活性. [方法] 在體外構(gòu)建人 HIF-1α基因腺病毒載體(Ad-HIF-1α)及其siRNA抑制載體(Ad-si HIE-1α);通過腺病毒介導(dǎo)人 HIF-1α基因(Ad-HIF-1α)入EPC,觀察感染后EPC在體外的擴增及遷移功能改變. [結(jié)果] 以MOI為70感染各組細(xì)胞6 h后,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率80﹪以上并持續(xù)至少1月,未發(fā)現(xiàn)明顯的腺病毒感染引起的凋亡;感染Ad-HI

8、F-1α后的EPC在體外細(xì)胞擴增數(shù)成倍增加,遷移功能改善(P<0.05),感染Ad-siHIF-1α后的EPC擴增及遷移功能受抑制. [結(jié)論] 在體外,通過腺病毒介導(dǎo)的方法基因修飾EPC初步認(rèn)為高效,細(xì)胞損傷小,體外Ad-HIF-1α感染EPC增加了EPC的成血管活性,為進一步在體內(nèi)實驗奠定了基礎(chǔ). 第三部分 Ad-HIF-1α-EPC對裸鼠缺血下肢血管新生的影響 [目的] 觀察腺病毒介導(dǎo)的HIF-1α在EPC中

9、的過表達在體內(nèi)是否有利于促進下肢局部缺血的恢復(fù). [方法] 實驗性下肢缺血的裸鼠造模,術(shù)后7天觀察造模是否成功;在體外通過腺病毒感染的方法介導(dǎo)人HIF-1α基因(Ad-HIF-1α)入EPC,經(jīng)尾靜脈將Ad-HIF-1α-EPC注入實驗性下肢缺血的裸鼠;基因及蛋白水平觀察HIF-1α的轉(zhuǎn)入;28天后大體標(biāo)本觀察缺血下肢的恢復(fù)情況;毛細(xì)血管計數(shù);TTC法觀察缺血面積;局部溫度測定及下肢多普勒血流測定. [結(jié)果]裸鼠左下肢股

10、動脈部分結(jié)扎切除術(shù)后7天造成下肢缺血,經(jīng)尾靜脈移植異種Ad-HIF-1α-EPC至裸鼠鼠缺血下肢后28天Ad-GFP-EPC組及Ad.-HIF-1αEPC組均未發(fā)現(xiàn)下肢自體離斷,Ad-HIF-1α-EPC組較Ad-GFP-EPC組下肢壞死降低60﹪(N=10).組織學(xué)上可見移植28 d后Ad-HIF-1α-EPC較GFP對照組進一步促進體內(nèi)毛細(xì)血管數(shù)目增加(P<0.05),缺血面積減小(20±2﹪vs.26±3﹪,P<0.05);功能學(xué)

11、上Ad-HIF-10c-EPC組幗窩局部皮溫回升、局部血流灌注增加. [結(jié)論]在體內(nèi),Ad-HIF-1α儀轉(zhuǎn)染后的EPC能促進EPC在體內(nèi)對缺血部位修復(fù)的作用,從形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、功能學(xué)等方面均證明其可促進缺血下肢的局部血管新生,為缺血性疾病的治療提供實驗依據(jù). 第四部分Ad-HIF-1α-EPC的靶向性作用及其機理研究 [目的]探討移植細(xì)胞經(jīng)全身循環(huán)后在體內(nèi)的定位;HIE-1α過表達對EPC的靶向定位的影響及可能

12、的機理. [方法]實時熒光檢測細(xì)胞移植后24 h大體標(biāo)本中Ad-GFP在裸鼠體內(nèi)的定位;HIA免疫組化測定外源性移植細(xì)胞在體內(nèi)的定位;免疫組化測定BrdU標(biāo)記的外源性移植細(xì)胞在體內(nèi)的擴增;Real-timePCR法及EUSA測定移植后缺血部位的趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(Stromal deftved factor,SDF)、CXCR4(SDF受體)及VEGF的表達. [結(jié)果]移植異種Ad-HIF-1αEPC至裸鼠缺血下肢

13、24h后可見外源性EPC聚集于缺血部位,HIA檢測示人源的移植細(xì)胞定位并參與缺血區(qū)域的毛細(xì)血管新生,Ad-HIF-1α轉(zhuǎn)染后的EPC增加移植細(xì)胞的成血管性;mRNA檢測提示過表達HIF-1α基因可上調(diào)其下游的SDF-1、CXCR4因子(P<0.05),增加EPC招募,同時促VEGF水平上調(diào)(P<0.05). [結(jié)論]在體內(nèi),移植的GFP-EPC可聚集于缺血區(qū)域并參與局部血管新生,Ad-HIF-1α感染后的EPC可進一步促進缺血下