穿膜肽RDP引導DNA的靶腦轉(zhuǎn)運及跨膜機制探究.pdf

1、血-腦屏障(BBB)的存在是CNS藥物發(fā)展緩慢的主要原因，它使得很多具有治療潛力的藥物難以發(fā)揮作用。因此，腦部疾病治療的關(guān)鍵在于尋找克服BBB或促進藥物透過BBB使之在腦內(nèi)能達到有效濃度的方法。傳統(tǒng)的腦部疾病治療方法立體定位手術(shù)，腦內(nèi)注射藥物，基因載體的直接輸送具有高侵入性，因其擴散范圍小、藥物維持時間短、表達效率低等弊端得不到廣泛的應用。
　　現(xiàn)今提出的一種新技術(shù)利用病毒或非病毒載體可將大分子活性藥物攜帶入腦。病毒載體有明顯的副

2、作用且不易進行靶向改造，反之非病毒載體具有了生物可降解性、生物相容性等優(yōu)勢，在治療CNS疾病中展現(xiàn)出了良好的應用前景。
　　已有研究報道證實多肽作為非病毒載體可攜帶寡核苷酸、siRNA或DNA穿過BBB，實現(xiàn)靶腦轉(zhuǎn)運。本實驗研究來源于狂犬病毒糖蛋白的一個新型衍生肽(RVG-derived peptide，RDP)，是否能夠引導DNA進行靶腦轉(zhuǎn)運及跨膜機理的初步探究。
　　在RDP引導DNA靶腦轉(zhuǎn)運的實驗中首先將RDP與含有報

3、告基因LacZ和EGFP的質(zhì)粒以非共價鍵的方式進行連接，通過瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗和圓二色譜確定RDP與DNA復合物的最佳比例以及相互作用。體內(nèi)實驗中，將實驗小鼠分為實驗組（尾靜脈注射最佳比例混合的RDP和DNA復合物），對照組（尾靜脈注射DNA）和空白對照組（尾靜脈注射生理鹽水），固定時間后處死小鼠，取其腦、肝、腎等組織，冷凍切片后進行X-gal染色和熒光觀察來確定目的蛋白在各組織中的表達情況。實驗結(jié)果表明，RDP/pDNA組小鼠的腦

4、、腎、脾可檢測到目的蛋白，腦中目的蛋白含量最多。對照組的目的蛋白只有出現(xiàn)在腎、脾組織中。因此證明RDP可作為基因治療的一種合適的靶腦載體，在未來的非病毒載體應用中可能具有較大的潛力。
　　在最后體外跨膜機制實驗研究中，我們發(fā)現(xiàn)實驗的HeLa、CHO和SH-SY5Y細胞中RDP只對神經(jīng)細胞SH-SY5Y具有特異性。在4度和37度條件下進行穿透實驗，RDP和RDP-EGFP在37度可以進入細胞而4度不能，表明RDP進入細胞具有能量依賴