納米給藥系統(tǒng)跨內耳圓窗膜轉運機理的研究.pdf

1、通過圓窗膜給藥的內耳局部給藥系統(tǒng)由于其有效性，非侵入性，繞過血迷路屏障以及降低在非靶向部位的毒性等優(yōu)點越來越受到耳科學家的青睞。近年來，納米粒給藥系統(tǒng)在內耳局部給藥方面的應用越來越廣泛，其小粒徑、高比表面積及高活性可以使納米粒有效穿透體內的各種生物學屏障。目前有關于納米藥物在內耳的研究主要集中于內耳的組織分布，藥動學以及藥效學研究。但是圓窗膜作為納米粒局部給藥系統(tǒng)主要的生物學屏障，目前并沒有對納米粒與圓窗膜之間的相互作用進行研究。而了解

2、清楚納米?？缭綀A窗膜的轉運機制的研究對于納米粒的進一步合理化設計是非常關鍵的。
　　聚乳酸羥基乙酸（PLGA）是FDA批準的可生物降解的藥用輔料，在內耳納米粒給藥系統(tǒng)方面有著非常廣泛的應用，采用乳化溶劑揮發(fā)法將香豆素-6包載入PLGA，制備香豆素-6標記的PLGA納米粒，對其在圓窗膜的通透性及轉運機制進行研究。豚鼠，鼓室注射PLGA納米粒30min后，分離出圓窗膜進行膜鋪片操作，采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現香豆素-6的綠色熒

3、光在圓窗膜中廣泛分布，說明納米?？梢赃M入圓窗膜；同時采集納米粒給藥后的外淋巴樣本進行透射電鏡觀察發(fā)現納米?？梢砸酝暾问竭M入外淋巴，說明了納米粒鼓室給藥后，可以穿越圓窗膜到達外淋巴空間。通過改變鼓室注射PLGA納米粒的濃度，選用了0.01g/ml，0.03g/ml及0.09g/ml三個濃度點對納米粒穿越圓窗膜進行濃度依賴性考察，結果發(fā)現圓窗膜內的熒光量隨著給藥濃度的增加而增加。選用了10min，30min及60min三個時間點，對PLG

4、A納米粒穿過圓窗膜進行時間依賴性考察，發(fā)現在給藥30min內，圓窗膜內的熒光量隨著時間的增加而增加，但是在30 min后，隨著時間的增加而降低。
　　對鼓室注射PLGA納米粒30 min的豚鼠圓窗膜進行透射電鏡觀察，與正常組的圓窗膜相比，給藥組的圓窗膜中發(fā)現了大量的內吞及胞吐小泡，同時圓窗膜外上皮細胞之間的緊密連接并沒有打開，因此可知PLGA跨越圓窗膜主要是通過內吞的方式進入細胞，在細胞內進行囊泡轉運，而不是通過細胞旁路途經。采用

5、抑制不同內吞途徑的抑制劑，發(fā)現PLGA納米粒主要是以小窩蛋白以及巨胞飲介導的內吞途徑進入細胞。對細胞內的溶酶體進行熒光標記，采用激光掃描共聚焦共定位技術，對溶酶體及香豆素-6標記的PLGA納米粒進行共定位，發(fā)現納米粒攝取進入細胞后，會進入細胞的溶酶體。采用與高爾基體相關的抑制劑發(fā)現細胞內的內質網及高爾基體可以介導納米粒的胞吐。
　　對內耳疾病進行合理有效的治療很大程度上取決于耳蝸內恒定的藥物濃度。殼聚糖（Chitosan,CS）是

6、一種生物可降解的聚合物，由于其粘附特性是一種優(yōu)良的藥物載體，可以增加納米粒與圓窗膜的接觸時間，同時殼聚糖具有打開上皮細胞間緊密連接的作用，可以增加納米粒的細胞旁路途經。采用離子交聯(lián)法制備載香豆素-6的CS納米粒，鼓室給藥后進行圓窗膜鋪片，采用激光掃描共聚焦顯微鏡成像后得到的圓窗膜的3D重建圖像以及外淋巴的透射電鏡充分證明了殼聚糖納米粒可以穿過圓窗膜進入外淋巴。對殼聚糖跨越圓窗膜進行時間依賴性考察，選取了5個給藥時間點，10min、30m

7、in、1h、2h及4h，結果顯示在給藥60min以前，圓窗膜中香豆素-6的熒光量隨著時間的延長而增加，但是在60min到240min的時間段內逐漸減弱；通過改變殼聚糖納米粒給藥的濃度，選用了3個濃度點5mg/ml，10mg/ml及20mg/ml，發(fā)現圓窗膜中殼聚糖納米粒的熒光量隨著給藥納米粒濃度的增加而增加，呈現濃度依賴性。
　　納米粒進入上皮屏障有細胞內和細胞間兩種途徑，采用透射電鏡對殼聚糖給藥后的圓窗膜進行成像，發(fā)現殼聚糖納米

8、?？梢砸约毎月芳翱缂毎麅煞N方式進入圓窗膜。采用不同途徑的內吞抑制劑處理圓窗膜發(fā)現殼聚糖納米粒以小窩蛋白，網格蛋白及巨胞飲三種途徑進入圓窗膜細胞，說明了殼聚糖納米粒與圓窗膜細胞之間的非特異性相互作用。采用熒光共定位技術觀察到了殼聚糖納米粒在溶酶體的分布，高爾基體相關的抑制劑說明殼聚糖納米?？梢栽趦荣|網及高爾基體的介導下胞吐出細胞。
　　綜上所述，本課題第一次直觀證明了PLGA納米粒及CS納米粒確實可以穿過圓窗膜到達外淋巴，并闡明了