多肽藥物匯利心康的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究.pdf

1、心肌肥大(cardiac hypertrophy)，又稱心肌肥厚，是高血壓、瓣膜病、慢性心衰及先天性心臟病等臨床常見疾病的一種并發(fā)癥。持續(xù)性的心肌肥厚最終可導(dǎo)致心衰和死亡。在心肌肥大發(fā)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，Gq蛋白處于樞紐地位，因此針對Gq蛋白設(shè)計特異性抑制藥物可同時阻斷眾多受體信號，比單一受體拮抗劑具有更強(qiáng)大的治療作用。
　　 多肽藥物匯利心康GCIP-27是由我室針對在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用的G蛋白α亞單位設(shè)計合成

2、的一種G蛋白競爭性抑制肽，前期的研究發(fā)現(xiàn)該多肽藥物能明顯阻止去甲腎上腺素和血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞肥大，明顯改善由NE注射或手術(shù)縮窄腹主動脈所誘導(dǎo)的小鼠、大鼠以及自發(fā)性高血壓大鼠的心肌肥大，其作用優(yōu)于卡托普利、氯沙坦和硝苯地平。
　　 Gq蛋白是7次跨膜蛋白，其α亞基羧基端暴露于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的胞漿中與受體結(jié)合，因此該藥物需進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與Gq蛋白競爭結(jié)合受體發(fā)揮抑制下游信號傳導(dǎo)作用?？缒まD(zhuǎn)運(yùn)是GCIP-27 發(fā)揮作用的

3、首要和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但細(xì)胞膜對于多肽藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)來講就是一個脂質(zhì)屏障。作為一種合成多肽，細(xì)胞膜上并無相應(yīng)已知的轉(zhuǎn)運(yùn)載體和通道。GCIP-27是否進(jìn)入細(xì)胞，又是如何進(jìn)入細(xì)胞成為一個亟待研究的問題。
　　 方法：
　　 1.正辛醇/水體系搖瓶法與高效液相色譜結(jié)合測定GCIP-27的脂水分配系數(shù)，判斷其親脂性和透膜能力。
　　 2.心肌細(xì)胞內(nèi)GCIP-27 轉(zhuǎn)運(yùn)量對時間和濃度的依賴性：用激光共聚焦顯微鏡觀測等量熒光標(biāo)記G

4、CIP-27在不同時間(1h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10h、12 h)里的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度和相同時間里不同濃度GCIP-27(1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/m)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的含量。
　　 3.在培養(yǎng)基中加入GCIP-27的同時，分別加入不同類型的細(xì)胞代謝能量抑制劑、胞吞抑制劑等，用激光共聚焦與流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化和攝取率，確定藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)方式。
　　

5、 4.通過比較不同類型細(xì)胞，包括心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和肝細(xì)胞，攝取GCIP-27的量，來確定藥物是否具有治療的靶向性。
　　 5. 用原子力顯微鏡和掃描電鏡觀察GCIP-27在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，心肌細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.分布平衡時，C 正辛醇/C水=129.856，脂水分配系數(shù)為2.113。
　　 2.GCIP-27與心肌細(xì)胞孵育2h后可在細(xì)胞內(nèi)觀察到

6、熒光，4h時藥物濃度達(dá)到最大值；且細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度隨著加入GCIP-27濃度增大而增加，至GCIP-27濃度為1μg/ml時細(xì)胞胞漿里含量最大。
　　 3.加入能量抑制劑2,4-二硝基苯肼和NaN3后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度分別降低74.66％和62.56％；內(nèi)吞抑制劑mβ-CD 處理后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度降低86.65％；mβ-CD和鹽酸氯丙嗪處理使細(xì)胞攝取率降低83.47％和71.03％。低溫4℃使攝取率降低了96.19％。
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7、.GCIP-27 進(jìn)入血管平滑肌和細(xì)胞心肌細(xì)胞的量，均明顯大于肝細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對藥物的攝??；僅有極少量進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 5. GCIP-27在心肌細(xì)胞中發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)時，心肌細(xì)胞膜褶皺度和表面粗糙度明顯增加，表面出現(xiàn)直徑300～500nm、深度100～200nm的小凹。
　　 結(jié)論：
　　 1.合成多肽藥物匯利心康GCIP-27能通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入心肌細(xì)胞，且主要分布在細(xì)胞漿內(nèi)；
　　 2.GCIP-