擬南芥磷酸丙糖-磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)器新生肽（preTPT）跨膜定位機(jī)理的研究.pdf

1、葉綠體是高等植物和某些藻類進(jìn)行光合作用的重要場(chǎng)所。葉綠體中95％以上的蛋白都是由核基因編碼，在胞質(zhì)中合成后，再轉(zhuǎn)運(yùn)至相應(yīng)部位的。指導(dǎo)這些蛋白正確靶向定位的大多是其N端信號(hào)序列，也稱導(dǎo)肽或信號(hào)肽(transitpeptide，tp)。但是目前葉綠體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理的研究結(jié)果非常少而且還存在一些分歧。因此，加強(qiáng)對(duì)葉綠體蛋白跨膜定位機(jī)理的研究具有十分重要的意義。磷酸丙糖/磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)器(TPT)由位于葉綠體內(nèi)被膜的勻質(zhì)二聚化蛋白組成，是一個(gè)高效率的運(yùn)

2、輸?shù)鞍?，也是光合同化物源?kù)分配的重要調(diào)控位點(diǎn)。至今關(guān)于preTPT(TPT新生肽)定位的分子機(jī)制研究非常少。 本文主要利用基因缺失、替換和定點(diǎn)突變以及酵母雙雜交等方法研究了擬南芥preTPT中指導(dǎo)其正確靶向定位的關(guān)鍵性元件以及與之識(shí)別結(jié)合的膜轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體組分，這對(duì)于闡明preTPT正確靶向葉綠體的定位機(jī)理，提高preTPT的運(yùn)送效率等具有重要的理論意義。并且為作物的遺傳改良和提高產(chǎn)量提供有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。 利用RT-PCR的

3、方法擴(kuò)增了擬南芥preTPT全長(zhǎng)cDNA。軟件分析結(jié)果表明，該基因全長(zhǎng)1233bp，編碼410個(gè)氨基酸；tp長(zhǎng)度為83個(gè)氨基酸；tp的N端部分帶有正電荷，并且有一個(gè)14-3-3蛋白的結(jié)合位點(diǎn)；該蛋白還有8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。為研究preTPT的定位機(jī)理，還擴(kuò)增了擬南芥葉綠體被膜蛋白ceQORH(醌類氧化還原酶)和線粒體被膜蛋白Tom20的cDNA片段。并構(gòu)建了preTPT-GFP，ceQORH-GFP的瞬時(shí)表達(dá)載體，并且在擬南芥葉片原生質(zhì)體中

4、獲得清晰表達(dá)，在亞細(xì)胞水平上證明preTPT定位于葉綠體被膜。至此，我們建立了優(yōu)良的瞬時(shí)表達(dá)體系，為進(jìn)一步研究preTPT的跨膜定位機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。 通過(guò)基因序列的缺失、替換和定點(diǎn)突變等方法分析preTPT中指導(dǎo)其跨膜定位的關(guān)鍵性元件。3’端缺失、替換分析結(jié)果表明完整的tp只能將融合蛋白靶向定位到葉綠體內(nèi)部，而不能指導(dǎo)其定位于被膜，要達(dá)到被膜定位還必須帶有preTPT的第一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，并且不可以用其它的跨膜結(jié)構(gòu)代替，表明第一跨

5、膜結(jié)構(gòu)域與葉綠體內(nèi)被膜有特異的識(shí)別和整合。對(duì)于不完整的tp(只含有preTPTN端60個(gè)氨基酸)，如在瞬時(shí)表達(dá)載體D5中，融合蛋白定位異常，星星點(diǎn)點(diǎn)的分布于葉綠體內(nèi)和胞質(zhì)內(nèi)，這可能是由于tp缺失太多，破壞了融合蛋白與被膜轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體組分的作用位點(diǎn)，削弱了跨膜運(yùn)送進(jìn)程。 進(jìn)一步對(duì)preTPT5’端的缺失、定點(diǎn)突變分析結(jié)果表明，preTPTN端的第2到第4個(gè)氨基酸區(qū)段對(duì)其葉綠體被膜定位不起主要作用；包含第五個(gè)氨基酸及其后一段氨基酸序列

6、的結(jié)構(gòu)域與與新生肽轉(zhuǎn)運(yùn)的起始相關(guān)，因?yàn)檫@一結(jié)構(gòu)域的缺失將導(dǎo)致融合蛋白停留在胞質(zhì)。另外，電荷作用力和14-3-3蛋白對(duì)preTPT跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的起始可能不起主要作用，因?yàn)閷pN端從正電狀態(tài)改變?yōu)橹行誀顟B(tài)或破壞14-3-3蛋白的結(jié)合位點(diǎn)均不影響其被膜定位。 酵母雙雜交分析表明，preTPTtp與擬南芥葉綠體被膜上的受體蛋白AtToc33和AtToc34均能發(fā)生相互作用。目前沒有實(shí)驗(yàn)證明其它葉綠體內(nèi)被膜蛋白利用TOC途徑跨膜定位，因此p

7、reTPT可能代表一類新的利用TOC途徑定位的葉綠體內(nèi)被膜蛋白。 上述結(jié)果勾畫出擬南芥葉綠體內(nèi)被膜蛋白preTPT的定位途徑，大致如下：首先新生肽最靠近N端的一個(gè)結(jié)構(gòu)域與胞質(zhì)某些輔助因子(14-3-3蛋白可能不起主要作用)以特定的方式(可能不是電荷作用)識(shí)別和結(jié)合，共同轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體被膜外側(cè)；然后與外被膜上的受體AtToc33和/或AtToc34識(shí)別結(jié)合，發(fā)生相互作用(可能還有其它TOC組分的參與)起始跨膜進(jìn)程；最后在第一個(gè)跨膜結(jié)