新型siRNA表達(dá)載體、隨機(jī)siRNA文庫的構(gòu)建及基于隨機(jī)siRNA文庫的細(xì)胞增殖相關(guān)基因篩選.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文新型siRNA表達(dá)載體、隨機(jī)siRNA文庫的構(gòu)建及基于隨機(jī)siRNA文庫的細(xì)胞增殖相關(guān)基因篩選姓名：張麗姝申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：沈巖梁子才20050501!璺!!塑墾型至堂豎主堡莖!蘭塑塞DNA。我們選擇化學(xué)合成質(zhì)量符合要求的隨機(jī)序列大量克隆到載體，構(gòu)建了siRNA瞬時(shí)表達(dá)文庫pBUH—RSL。pBUH_RSL文庫的獨(dú)立克隆數(shù)為5107；其中有效克隆占‘90％：隨

2、機(jī)siRNA編碼區(qū)的GC含量40％。在此基礎(chǔ)上我們用轉(zhuǎn)移pBUtIRSL文庫編碼框的方法構(gòu)建了一個(gè)真核穩(wěn)定表達(dá)siRNA文庫pCUH，文庫的獨(dú)立克隆_RSL數(shù)為1108，有效克隆98％，小量測序未發(fā)現(xiàn)文庫序列多拷貝重復(fù)的情況。我們用pCUH文庫進(jìn)行了細(xì)胞增殖相關(guān)基因的篩選研究。文庫_RSLpCUHRSL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MC3T3El細(xì)胞，在G418的選擇壓力F傳代培養(yǎng)60天。這樣，因表達(dá)某種siRNA而獲得增殖加快表型的細(xì)胞會(huì)在連續(xù)的細(xì)胞傳代過

3、程中逐漸得到富集。收集篩選結(jié)束時(shí)的細(xì)胞，此時(shí)轉(zhuǎn)染文庫組細(xì)胞的增殖速度明最快于陰性對照細(xì)胞，提示文庫中的某些成員的確起到了促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。通過PCR／克?。瘻y序的方法獲知這些細(xì)胞中所轉(zhuǎn)染的siRNA序列。當(dāng)表達(dá)這些siRNA的pCUH質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)染MC3T3E1細(xì)胞，一些siRNA再次明顯的促進(jìn)了細(xì)胞增殖，如cloneB7，B38，A66，B13等。進(jìn)一步的驗(yàn)證及這些siRNA預(yù)計(jì)靶基因的功能研究工作正在進(jìn)行中。相向雙啟動(dòng)子模式的siI

4、NA表達(dá)框是siRNA表達(dá)框方式上的新突破，我們構(gòu)建的基于HI／U6相向雙啟動(dòng)子表達(dá)框的質(zhì)粒pBUH、pCUH、pEGUH具有優(yōu)于現(xiàn)有短發(fā)夾型siRNA表達(dá)載體的特性，如，連接效率高、穩(wěn)定、測序無障礙等，最重要的，用這類siRNA表達(dá)載體可以很簡便地構(gòu)建各種siRNA文庫。我們成功構(gòu)建了5lO7的隨機(jī)siRNA文庫，是這一類型的siRNA文庫的首次報(bào)道。用這一文庫進(jìn)行的增殖基因篩選工作己初步顯示了這種文庫在基因功能研究中的良好應(yīng)用潛能。