siRNA表達(dá)載體介導(dǎo)的RNA干擾抑制新型隱球菌cap10基因的表達(dá).pdf

1、目的：構(gòu)建針對(duì)新型隱球菌cap10基因的siRNA表達(dá)載體質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入新型隱球菌中，評(píng)價(jià)siRNA表達(dá)載體質(zhì)粒對(duì)新型隱球菌(Cryptococcus neoformans，CN)莢膜相關(guān)蛋白(capsule associated protein，CAP)基因cap10表達(dá)的抑制效應(yīng)，為新型隱球菌感染的治療奠定基礎(chǔ)。 方法：以cap10基因?yàn)榘谢?，根?jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的cap10基因核苷酸序列，按照干擾模板設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用

2、網(wǎng)絡(luò)在線軟件確定一個(gè)針對(duì)cap10 mRNA的RNAi(RNAinteference，RNAi)靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)1對(duì)可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核苷酸序列，將其復(fù)性后插入載體質(zhì)粒psilencer4.1-CMV neo，構(gòu)建重組體。用LiAc化學(xué)法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染新型隱球菌細(xì)胞，確定G418篩選的濃度并篩選成功轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性菌株。構(gòu)建cap10基因表達(dá)熒光定量PCR檢測(cè)體系：比對(duì)新型隱球菌5種血清型(A、B、C、D、AD)的cap10基因序列，找出同源序列來(lái)設(shè)

3、計(jì)引物和探針，并將其PCR擴(kuò)增基因片段克隆到pGEM-T Easy載體上，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；建立FQ-PCR體系，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行敏感性、特異性、重復(fù)性試驗(yàn)；將各組新型隱球菌培養(yǎng)后抽提總RNA，利用熒光定量檢測(cè)體系分別測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組cap10基因的表達(dá)情況。取培養(yǎng)后的新型隱球菌與巨噬細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)株J774A.1進(jìn)行共孵育，經(jīng)過(guò)PBS沖洗和甲醇固定，用吉姆薩染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察，計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。用SPSS13.

4、0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 1.靶向cap10基因的siRNA表達(dá)載體質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列一致； 2.抽提新型隱球菌陽(yáng)性克隆中的質(zhì)粒，序列測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列完全相同。 3.cap10基因表達(dá)的熒光定量檢測(cè)體系檢測(cè)敏感度為104copies/μl，線性范圍為104～1010 copies/μl，批內(nèi)CV為0.31％，批間CV為2.73％。 4.pS4.1-siRC-1轉(zhuǎn)染干擾組新型

5、隱球菌的cap10基因表達(dá)平均拷貝數(shù)為175534.62copies/μl，明顯低于對(duì)照實(shí)驗(yàn)組(321995.52copies/μl)和空白實(shí)驗(yàn)組(562931.66copies/μl)(均P<0.05)，平均抑制率為30.58％。 5.新型隱球菌與巨噬細(xì)胞株J774A.1共孵育后，pS4.1-siRC-1轉(zhuǎn)染干擾組平均吞噬指數(shù)為0.128971212，吞噬率為10.06％，明顯均高于對(duì)照實(shí)驗(yàn)組(0.078898104，6.57