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1、目的：構(gòu)建Fas（CD95）特異性的siRNA真核表達(dá)載體psilencircle-FasSi，轉(zhuǎn)染Fas-FasL凋亡途徑敏感性細(xì)胞株Jurkat，進(jìn)而研究運(yùn)用RNAi技術(shù)下調(diào)Fas的抗凋亡作用。 方法：根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，運(yùn)用生物信息學(xué)設(shè)計(jì)siRNA靶點(diǎn)，以PCR制備siRNA表達(dá)框架(siRNA expression cassettes，SECs)，轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)Fas的抑制率，篩選出抑
2、制Fas效率較高的siRNA靶點(diǎn)；將上述篩選出的siRNA序列插入siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒psilencircle中，構(gòu)建psilencircle-FasSi。Psilecircle-FasSi轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)Fas的mRNA、Western blot檢測(cè)Fas蛋白的抑制率；anti-Fas mAb刺激Jurkat細(xì)胞凋亡，Annexin-Ⅴ-FITC/PI雙色熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果
3、：構(gòu)建的psilecircle-FasSi StuⅠ酶切電泳，可見4800bp左右的條帶，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列一致，表明psilecircle-FasSi真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。Psilecircle-Fas Si轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞表達(dá)后，實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)Fas mRNA、Western blot檢測(cè)Fas蛋白，與未轉(zhuǎn)染組相比明顯抑制了Fas基因的表達(dá)；anti-Fas mAb刺激Jurkat細(xì)胞凋亡，Annexin-Ⅴ-FITC/
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