利用人轉(zhuǎn)錄因子siRNA文庫篩選凋亡相關siRNA.pdf

1、RNA干擾(RNA interference，RNAi)是雙鏈RNA分子引發(fā)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程。該現(xiàn)象廣泛存在于多物種中。RNA干擾所致的同源基因降解現(xiàn)象引起生物學家的廣泛關注并將其改造成一種人為的基因阻斷技術(shù)，用于基因功能的研究。由于長雙鏈RNA分子在哺乳動物細胞能引起非特異性的干擾素反應，RNAi技術(shù)的應用最初局限于線蟲、果蠅等低等生物。隨著siRNA(small interfering RNA)特異性抑制作用的發(fā)現(xiàn)，R

2、NAi技術(shù)的應用范圍延伸到哺乳動物；并且從對單一、特定基因的研究迅速推及全基因組水平的功能研究，以此為契機推動了siRNA文庫的構(gòu)建和使用siRNA文庫進行高通量篩選。 凋亡又叫做程序性細胞死亡。凋亡有其特有的形態(tài)學特點和生化機制。凋亡對于各種生命過程非常重要，如正常的細胞更新、發(fā)育和免疫反應，激素依賴性組織萎縮，胚胎發(fā)育和化學物質(zhì)誘導凋亡等。凋亡失常與許多人類疾病有關，如神經(jīng)退行性疾病、缺血損傷、自身免疫和腫瘤等。調(diào)節(jié)細胞凋亡

3、對于治療這些疾病非常重要。因此，很多研究致力于分析闡明細胞凋亡的機制和信號通路。 我們利用人轉(zhuǎn)錄因子siRNA文庫在Jurkat細胞中篩選凋亡相關siRNA。siRNA文庫穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞后使用rhTRAIL誘導凋亡。由于siRNA作用，那些具有抗凋亡特性的細胞將會存活、增殖，其他細胞將會被篩除。最終，那些具有抗凋亡特性的細胞在細胞群中得以富集。經(jīng)過3輪篩選，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人轉(zhuǎn)錄因子siRNA文庫的實驗組細胞較穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NC的陰性對照組細胞

4、具有顯著增強的抗凋亡能力。隨后通過PCR--克隆--測序的方法獲知這些陽性細胞中所轉(zhuǎn)染的siRNA表達片段序列。然后這些siRNA表達片段的抗凋亡作用被逐個驗證。其中部分siRNA表達片段在Jurkat細胞中表現(xiàn)出明確的抗細胞凋亡作用。 綜上所述，我們建立了基于細胞功能表型的高通量siRNA文庫篩選方法；用人轉(zhuǎn)錄因子siRNA文庫成功地進行了大規(guī)模篩選，獲得了多個與細胞凋亡相關的siRNA序列。為發(fā)現(xiàn)新的凋亡相關基因奠定了基礎。