針對(duì)Edg4基因的siRNA載體構(gòu)建及其沉默作用.pdf

1、背景和目的： 卵巢癌是一種常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，是臨床上難治性腫瘤之一，由于位置深居盆底，缺乏早期癥狀和體征，75﹪-80﹪的患者確診時(shí)已屬晚期，造成卵巢癌診斷和治療上的困難。因此，卵巢癌是死亡率最高、危害最大的婦科惡性腫瘤。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)是一種細(xì)胞膜脂類衍生物，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者血漿及腹水中LPA水平明顯升高，體外實(shí)驗(yàn)證明降低LPA水平可以抑制卵巢腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。

2、LPA可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、生存、蛋白酶的產(chǎn)生和激活、促進(jìn)血管生成因子等細(xì)胞因子的生成，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸滑、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。因而影響LPA的產(chǎn)生、代謝、受體表達(dá)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有重要意義，有可能成為卵巢癌治療的一種新途徑。 溶血磷脂酸即1-脂酰甘油3-磷酸酯(1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate)，其基本結(jié)構(gòu)包含磷酸基、甘油骨架及長(zhǎng)鏈脂肪酸三部分。LPA是一種脂類小分子物質(zhì)，是膜

3、來(lái)源的具有生物活性的脂類遞質(zhì)，為脂質(zhì)代謝的一個(gè)中間產(chǎn)物，有細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)作用。LPA主要通過(guò)其受體即G蛋白受體介導(dǎo)的多種信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮其多樣的生物學(xué)效應(yīng)。目前已知的人類LPA受體有三種，即內(nèi)皮分化基因蛋白(endothelial differentiationgene，Edg)Edg2，Edg4，Edg7。其中Edg2在正常卵巢細(xì)胞、永生化的卵巢細(xì)胞中均穩(wěn)定表達(dá)，Edg4和Edg7則在卵巢癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)，在正常卵巢細(xì)胞、永生化的卵巢細(xì)胞

4、不表達(dá)或低表達(dá)。因此，Edg4和Edg7的表達(dá)可能與LPA對(duì)腫瘤的作用有關(guān)。 近幾年來(lái)興起的RNA干擾技術(shù)，為腫瘤的分子生物學(xué)治療開(kāi)辟了新的途徑。與傳統(tǒng)基因沉默技術(shù)相比，RNA干擾技術(shù)具有效果強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)，目前這一技術(shù)已在腫瘤的基因治療方面顯示出誘人的前景。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建針對(duì)LPA受體Edg4的siRNA重組載體，將siRNA對(duì)應(yīng)的DNA發(fā)卡樣雙鏈序列克隆入載體內(nèi)，轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV3細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Edg4靶向的siR

5、NA分子，特異性沉默Edg4基因，從而阻斷LPA的作用，抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，為卵巢癌的基因治療尋找新的方法和靶點(diǎn)。方法依據(jù)GenBank中Edg4基因(NM_004720)的序列，遵循h(huán)ttp：//www．a(chǎn)mbion．com/tec hlib/misc/siRNA-design．html原則進(jìn)行設(shè)計(jì)，對(duì)候選序列通過(guò)美國(guó)生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)的在線

6、同源序列檢索http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/Blast，選擇確定19個(gè)堿基的siRNA靶序列。分別合成2對(duì)靶向Edg4siRNA序列，退火成雙鏈DNA，克隆入pGEM-T Easy載體，利用Q互補(bǔ)和T7/SP6 PCR擴(kuò)增篩選鑒定重組子pGEM-T-siEdg4-1和pGEM-T-siEdg4-2；用BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶雙酶切重組子和siRNA表達(dá)載體pRNAT-U6．1；將雙粘Edg4發(fā)卡樣siRN

7、A片段亞克隆入siRNA表達(dá)載體pRNAT-U6．1中；利用通用引物篩選鑒定重組子pRNAT-U6．1-siEdg4-1和pRNAT-U6．1-siEdg4-2；對(duì)插入序列進(jìn)行DNA序列分析。將siRNA表達(dá)載體pRNhT-U6．1-siEdg4-1和pRNAT-U6．1-siEdg4-2轉(zhuǎn)染入人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3中，利用熒光顯微鏡觀察SKOV3細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染情況；用熒光定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞Edg4mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果：

8、 1．針對(duì)Edg4 siRNA得到20個(gè)候選靶區(qū)段，對(duì)上述候選序列通過(guò)美國(guó)生物技術(shù)信息中心的在線同源序列檢索，最后確定212-230位(GACCATCGGCTTCTTCTAT)和323-341位(GACCAATCTGCTGGTCATA)為siRVA靶序列。 2． siRNA發(fā)卡DNA退火后，電泳可見(jiàn)明亮條帶，位于約70bp處，與設(shè)計(jì)完全一致。 3．退火產(chǎn)物與pGEM-T Easy連接后，轉(zhuǎn)化JM109，篩選鑒定后

9、得到重組子pGEM-T-siEdg4-1和pGEM-T-siEdg4-2。 4．亞克隆后，用通用引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，得到pRNAT-U6．1-siEdg4-1和pRNAT-U6．1-siEdg4-2。 5．對(duì)重組子pRNAT-U6．1-siEdg4-1和pRNAT-U6．1-siEdg4-2插入片段DNA序列測(cè)序，結(jié)果與設(shè)計(jì)完全一致。 6．轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用熒光顯微鏡觀察卵巢癌細(xì)胞可看見(jiàn)大量GFP表達(dá)，經(jīng)G41

10、8篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞得到對(duì)其有抗性的細(xì)胞群落。 7．轉(zhuǎn)染Edg4靶向siRNA(pRNAT-U6．1-siEdg4-1，pRNAT-U6．1-siEdg4-2)的實(shí)驗(yàn)組卵巢癌細(xì)胞中Edg4 mRNA表達(dá)水平明顯降低。而兩個(gè)對(duì)照組(空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞中都存在較高水平的Edg4 mRNA表達(dá)。 結(jié)論： 1．設(shè)計(jì)出針對(duì)Edg4的發(fā)卡樣siRNA寡核苷酸片段。 2．成功‘構(gòu)建出針對(duì)Edg4的s