VEGF-A-siRNA和CXCR4-siRNA慢病毒載體的構(gòu)建及對(duì)卵巢癌的基因治療.pdf

1、目的：構(gòu)建針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和趨化因子受體4（CXCR4）慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾載體，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察卵巢癌細(xì)胞VEGF和CXCR4表達(dá)受抑制后對(duì)癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移情況的影響，部分闡明VEGF/CXCR4基因表達(dá)被抑制后對(duì)卵巢癌的發(fā)生與進(jìn)展的影響，為針對(duì)VEGF/CXCR4基因的RNA干擾技術(shù)的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法：（1）將VEGF基因mRNA和CXCR4基因mRNA作為RNA干擾的靶區(qū)，通過(guò)E-R

2、NAi網(wǎng)上提供的在線服務(wù)，設(shè)計(jì)多個(gè)特異的RNA干擾序列，將其裝入含U6和H1啟動(dòng)子的慢病毒載體FIV-based Lentivector Expression System上，構(gòu)建成抑制VEGF和CXCR4基因表達(dá)的RNA干擾（siRNA）表達(dá)載體。（2）體外實(shí)驗(yàn)中，將上述載體轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞株sw626，通過(guò)Real time PCR和Western blot觀察干擾載體對(duì)VEGF和CXCR4表達(dá)的抑制效果；通過(guò)CCK8檢測(cè)對(duì)腫瘤細(xì)胞

3、增殖的影響；通過(guò)重建基底膜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體外侵襲能力的變化。（3）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將上述載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后注射裸鼠建立卵巢癌模型；通過(guò)檢測(cè)成瘤率、成瘤時(shí)間、瘤體大小、繪制生長(zhǎng)曲線，觀察靶基因表達(dá)受抑制后，腫瘤增長(zhǎng)的變化。腫瘤組織通過(guò)檢測(cè)CD34表達(dá)對(duì)MVD進(jìn)行比較，同時(shí)采用TUNEL檢測(cè)腫瘤組織凋亡的變化。 結(jié)果：（1）成功構(gòu)建了抗VEGF和CXCR4的siRNA慢病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，測(cè)序證實(shí)序列正確。（2）體外實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)Real tim

4、e PCR和Western blot，在人卵巢癌細(xì)胞株sw626中，VEGF和CXCR4慢病毒表達(dá)載體能明顯抑制靶基因的表達(dá)；CCK8顯示，當(dāng)VEGF受抑制后，腫瘤細(xì)胞增殖受抑；重建基底膜實(shí)驗(yàn)證實(shí)CXCR4表達(dá)受抑后細(xì)胞體外侵襲能力顯著降低。（3）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，VEGF和CXCR4被抑制后可減緩瘤體增長(zhǎng)，腫瘤組織MVD下降，細(xì)胞凋亡增加。 結(jié)論：（1）針對(duì)VEGF和CXCR4基因的siRNA慢病毒表達(dá)載體能夠顯著抑制靶基因的表達(dá)（