針對(duì)HLA-G基因的siRNA的載體構(gòu)建與表達(dá)及效應(yīng)檢測(cè).pdf

1、人類白細(xì)胞抗原-G（humanleukocyteantigen-G，HLA-G）是位于人第六號(hào)染色體短臂上的一群緊密連鎖基因群，HLA-G屬于非經(jīng)典HLA-I類分子，是表達(dá)于母胎界面滋養(yǎng)層的HLA-I類基因，是重要的免疫耐受分子。主要有3個(gè)特點(diǎn)：選擇性組織分布；有限的分子多態(tài)性；mRNA選擇性剪接形成不同的異構(gòu)體分子，分別編碼不同的蛋白質(zhì)分子亞型。HLA-G編碼基因及分子結(jié)構(gòu)與經(jīng)典HLA-I類分子相似。 早期認(rèn)為HLA-G限制

2、性表達(dá)于正常妊娠時(shí)母胎界面的絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)HLA-G蛋白還表達(dá)于胎兒絨毛膜絨毛的血管內(nèi)皮細(xì)胞、羊水、絨毛基底層的增殖性細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞及胸腺上皮組織等部位。HLA-G這種獨(dú)特的表達(dá)方式對(duì)于維持正常妊娠有著重要的作用，育齡婦女HLA-G基因表達(dá)異常會(huì)引起不孕、習(xí)慣性流產(chǎn)、妊娠高血壓疾病等病理性妊娠。 近來發(fā)現(xiàn)，HLA-G分子還能抑制NK細(xì)胞、T細(xì)胞的細(xì)胞溶解作用、誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞凋亡，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而影

3、響機(jī)體免疫反應(yīng)。因此，HLA-G是人類生殖中的重要調(diào)控蛋白，研究HLA-G基因在妊娠中的功能在人類生殖學(xué)和免疫學(xué)具有重要的理論意義，有望成為人類輔助生殖中評(píng)價(jià)胚胎潛能的重要生化指標(biāo)。 外源和內(nèi)源性雙鏈RNA(double-strandedRNA.dsRNA)在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)同源序列基因表達(dá)受抑制的現(xiàn)象稱為RNA干擾(RNAinterfering.RNAi)。RNAi現(xiàn)象在一系列的生物中存在，包括植物、真菌、錐蟲、囊蟲、果蠅和線蟲。

4、在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也觀察到這一現(xiàn)象。越來越多的研究人員開始采用小分子干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)來抑制特定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因的表達(dá)。RNAi技術(shù)研究結(jié)果表明構(gòu)建的載體有效表達(dá)了siRNA，這些載體術(shù)不僅能提供一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段，而且在基因功能測(cè)定，基因治療等方面開辟一條新思路。 目的： 1.構(gòu)建針對(duì)HLA-G基因的siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒載體，將其轉(zhuǎn)染人

5、絨癌JEG-3細(xì)胞株，觀察其對(duì)人絨癌細(xì)胞JEG-3中HLA-G蛋白表達(dá)的沉默效應(yīng)； 2.建立HLA-G穩(wěn)定降調(diào)節(jié)的JEG-3細(xì)胞株； 3.針對(duì)HLA-G蛋白的降表達(dá)對(duì)NK-92MI細(xì)胞殺傷效應(yīng)的檢測(cè)。 方法： ①依據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，結(jié)合HLA-G基因的序列特征，借助生物信息學(xué)軟件在線設(shè)計(jì)了兩對(duì)靶向HLA-G基因的siRNA，并經(jīng)本室檢測(cè)有明顯抑制效應(yīng)。應(yīng)用基因重組技術(shù)，構(gòu)建HLA-G基因的si

6、RNA真核表達(dá)質(zhì)粒載體pSuppressor-U6-neo-HLA-G(簡(jiǎn)稱pSup-HLA-G)及陰性對(duì)照pSuppressor-U6-neo-ns(簡(jiǎn)稱pSup-ns)，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。應(yīng)用脂質(zhì)體分別將質(zhì)粒pSup-HLA-G，pSuppressor-U6-neo空載體、pSuppressor-U6-neo-ns瞬時(shí)轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR、Western-blot等方法鑒定瞬時(shí)轉(zhuǎn)染前后各組JEG-3細(xì)胞中HLA-G基因

7、mRNA及蛋白表達(dá)水平有無變化； ②經(jīng)過G418抗性篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，應(yīng)用RT-PCR、Western-blot等方法檢測(cè)、比對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染siRNA真核表達(dá)載體前后JEG-3細(xì)胞中HLA-G基因mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化情況； ③將NK-92MI細(xì)胞（效應(yīng)細(xì)胞）與JEG-3細(xì)胞及降調(diào)節(jié)HLA-G的JEG-3細(xì)胞（靶細(xì)胞）共同培養(yǎng)，以LDH釋放法觀察不同效靶比例時(shí)NK-92MI細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。

8、 結(jié)果： ①成功地構(gòu)建了HLA-G基因siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒載體pSup-HLA-G，RT-PCR及Western-blot等方法檢測(cè)表明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA及pSup-HLA-G的JEG-3細(xì)胞中HLA-G基因mRNA及蛋白表達(dá)均受到明顯抑制； ②建立了穩(wěn)定降調(diào)節(jié)HLA-G基因表達(dá)的JEG-3細(xì)胞株； ③NK-92MI細(xì)胞針對(duì)轉(zhuǎn)染HLA-G的siRNA的滋養(yǎng)細(xì)胞的殺傷力增強(qiáng)了，說明HLA-G具有保護(hù)滋養(yǎng)細(xì)胞