靶向人ERG基因的siRNA重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、目的:構(gòu)建靶向人ERG基因的siRNA重組慢病毒表達(dá)載體，并在TMPRSS2-ERG融合基因陽性前列腺癌細(xì)胞株VCaP中驗(yàn)證ERGsiRNA對ERG基因表達(dá)的抑制作用。
　　方法:(1)針對人ERG基因的mRAN序列，設(shè)計(jì)特異性干擾序列，兩端引入BamHⅠ與EcroRⅠ酶切位點(diǎn)，人工合成OligoDNA，退火形成雙鏈DNA(dsDNA)。慢病毒載體質(zhì)粒pLVX-shRNA2經(jīng)BamHⅠ與EcroRⅠ雙酶切，回收載體片段。載體片段與

2、退火后的雙鏈DNA連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α，在含AMP的LB平板上篩選陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行測序，鑒定連接正確的重組質(zhì)粒命名為pLVX-shRNA2-ERGsiRNA。
　　(2)重組質(zhì)粒pLVX-shRNA2-ERGsiRNA和空白質(zhì)粒pLVX-shRNA2分別與包裝質(zhì)粒(pHelper1.0和pHelper2.0)以脂質(zhì)體法共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染48h后的培養(yǎng)上清，經(jīng)濃縮獲得荷載ERGsiRNA基因的重組慢病毒和空白

3、慢病毒;采用逐孔稀釋滴度測定法，分別以重組慢病毒和空白慢病毒感染293T細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)水平計(jì)算病毒滴度。
　　(3)體外培養(yǎng)VCaP細(xì)胞，分為三組，一組常規(guī)培養(yǎng)，另兩組分別以兩種病毒感染，通過細(xì)胞內(nèi)熒光蛋白表達(dá)情況估算病毒感染效率;分別收集兩種病毒感染細(xì)胞和常規(guī)培養(yǎng)的VCaP細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總RNA，電泳檢測總RNA的完整性，紫外分光光度計(jì)測定0D260和0D280計(jì)算總RNA濃度和純度;取每組總RNA

4、1μg行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組ERGmRNA的表達(dá);收集各組Ct值行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間比較采用One-way ANOVA單因素方差分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;以空白病毒組為對照，通過2-△△Ct法計(jì)算siRNA對ERG基因的抑制效率。
　　結(jié)果:
　　(1)慢病毒載體質(zhì)粒pLVX-shRNA2雙酶切后電泳鑒定酶切完全，與退火dsDNA連接后轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞DH5α，篩選出陽性菌并擴(kuò)增提取質(zhì)粒進(jìn)行測序

5、，結(jié)果表明連接正確，說明靶向人ERG基因的siRNA載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　(2)載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)48h后熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)，表明三種質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)成功重組出慢病毒;逐孔稀釋滴度測定法測得重組慢病毒LV-ERGsi滴度為1.1×108 TU/ml，空白慢病毒LV-NC滴度為1.8×108 TU/ml。
　　(3)兩種慢病毒分別感染VCaP細(xì)胞，48h后通過觀察細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)情況估

6、算病毒感染效率約為80％;收集各組細(xì)胞提取總RNA，經(jīng)電泳檢測提取完整，計(jì)算濃度和純度符合要求;各組總RNA逆轉(zhuǎn)錄后經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，LV-ERGsi組的ERGmRNA表達(dá)水平明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析LV-ERGsi組與LV-NC組和空白細(xì)胞組之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);通過計(jì)算得出siRNA對ERG基因表達(dá)的干擾效率為87.46％。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建靶向人ERG基因的siRNA重組慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)