靶向大鼠OPN基因的siRNA表達載體的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、目的：
　　 通過構(gòu)建靶向大鼠骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）基因的RNAi載體，并轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的血管平滑肌細胞，檢測并鑒定OPN基因RNAi表達載體在血管平滑肌細胞中介導的基因沉默效應，為后續(xù)研究提供有力的工具，為實現(xiàn)冠狀動脈旁路移植術(shù)后橋血管再狹窄的基因治療提供新的手段。
　　 方法：
　　 1.采用組織貼塊法進行大鼠胸腹主動脈血管平滑肌細胞的原代培養(yǎng)，胰酶消化法傳代，液氮凍存，并應用倒置相差顯微鏡

2、和SP法免疫組化染色對細胞進行鑒定。
　　 2.通過在Gene Bank中檢索的大鼠骨橋蛋白的mRNA序列，依據(jù)相關(guān)原則，設(shè)計表達OPN基因siRNA片斷的基因序列，化學合成DNA寡核苷酸，經(jīng)過退火、酶切、連接、擴增等方法構(gòu)建表達OPN基因siRNA片斷的質(zhì)粒載體。并通過免疫熒光技術(shù)檢測其轉(zhuǎn)染效率。
　　 3.設(shè)計并合成能轉(zhuǎn)錄OPN基因RNAi片斷的DNA序列，進而通過穿梭質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染效率檢測、病毒包裝等步驟完成靶巴向

3、大鼠OPN基因的RNAi慢病毒表達載體的構(gòu)建。進一步通過免疫熒光技術(shù)檢測其對血管平滑肌細胞的轉(zhuǎn)染效率。
　　 結(jié)果：
　　 1.血管平滑肌細胞培養(yǎng)顯示，85％的組織塊接種存活，顯微鏡下細胞呈典型的“谷峰狀”生長，SP法免疫組化染色鑒定顯示胞漿內(nèi)α平滑肌肌動蛋白表達陽性。
　　 2.大鼠OPN基因特異性RNAi質(zhì)粒載體構(gòu)建成功，但其對離體C6細胞的轉(zhuǎn)染效率不足10％。
　　 3.靶向大鼠OPN基因的RNAi

4、慢病毒表達載體構(gòu)建成功，其對血管平滑肌細胞的轉(zhuǎn)染效率達到70％。
　　 結(jié)論：
　　 1.應用組織貼塊法簡便易行，短期內(nèi)可獲得大量符合后續(xù)試驗要求的血管平滑肌細胞。
　　 2.利用pMDTM19-T vector可成功構(gòu)建出符合所設(shè)計的目的基因的RNAi質(zhì)粒表達載體，但細胞轉(zhuǎn)染實驗證實，大鼠OPN基因特異性RNAi質(zhì)粒表達載體對離體細胞的轉(zhuǎn)染效率低下，無法用做進一步實驗的有效RNAi表達載體。
　　 3.