高壓氧治療對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)后炎性因子無(wú)論在繼發(fā)性損傷的起始或發(fā)展階段都起到了重要的作用，是造成繼發(fā)性損傷的主要原因之一，高壓氧(HBO)治療減輕繼發(fā)性損傷。本研究假說(shuō)認(rèn)為:HBO治療改善TBI后大鼠神經(jīng)功能，其作用機(jī)制途徑之一是抑制損傷區(qū)皮層CCL2-CCR2的表達(dá)。
　　目的:
　　第一部分:探索CCL2-CCR2對(duì)大鼠TBI后神經(jīng)功能的影響。
　　第二部分:HBO治療對(duì)TBI大鼠神經(jīng)功能的作用及可能作

2、用機(jī)制。
　　方法:
　　第一部分:
　　1.采用Feeney's自由落體法制備TBI模型。
　　2.采用平衡木測(cè)試評(píng)分評(píng)估大鼠的平衡功能;網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)功能;水迷宮測(cè)試評(píng)估大鼠認(rèn)知功能。
　　3.采用尼氏染色法顯示損傷皮層區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。
　　4.用Real-time PCR法檢測(cè)CCL2 mRNA和CCR2 mRNA的表達(dá)。
　　5.免疫熒光染色檢測(cè)CCL2、CCR2的免疫陽(yáng)性細(xì)胞

3、變化情況;免疫熒光雙標(biāo)染色檢測(cè)CCL2、CCR2的細(xì)胞定位。
　　6.采用TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。
　　7.采用CCR2拮抗劑藥物干預(yù)，觀察其對(duì)神經(jīng)功能、神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。
　　第二部分:
　　1.采用平衡木測(cè)試評(píng)分、網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)和水迷宮測(cè)試觀察HBO治療后TBI大鼠神經(jīng)功能的變化。
　　2.觀察HBO治療后腦含水量的變化。
　　3.采用Real-time PCR法檢測(cè)HBO治療后TBI大鼠損傷

4、區(qū)皮層CCL2mRNA和CCR2 mRNA的變化。
　　4.用western blot法檢測(cè)HBO治療后CCR2和caspase-3蛋白含量變化。
　　結(jié)果:
　　第一部分:
　　1.大鼠腦外傷后運(yùn)動(dòng)功能、平衡功能和認(rèn)知功能較Sham組均明顯下降，可持續(xù)14d或21d以上。
　　2.尼氏染色顯示損傷皮層區(qū)神經(jīng)元排列稀疏紊亂、細(xì)胞間距增大、大量固縮壞死，神經(jīng)元胞體萎縮、尼氏體減少或消失。
　　3.Rea

5、l-time PCR檢測(cè)顯示， TBI術(shù)后1-21 d CCL2 mRNA和CCR2 mRNA較Sham組均顯著增高，術(shù)后3d表達(dá)量最大。
　　4.免疫熒光染色結(jié)果顯示，與Sham組相比，TBI后1d、3d、7d和10d腦損傷區(qū)皮層CCL2和CCR2均表達(dá)上調(diào)，術(shù)后3d為CCL2和CCR2表達(dá)的高峰期。
　　5.免疫熒光雙標(biāo)染色表明大鼠皮層CCL2主要與星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物GFAP共存，表明CCL2主要表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞;C

6、CR2主要與神經(jīng)元的標(biāo)記物NeuN共存，表明CCR2主要表達(dá)在神經(jīng)元。
　　6.TBI后1d腦損傷皮層內(nèi)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量最多，其后漸漸下降。與Sham組相比，術(shù)后1d、3d、5d和7 d TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量均顯著增多，其中TBI后1d TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多。
　　7.給予CCR2拮抗劑RS504393連續(xù)3天后，TBI大鼠神經(jīng)功能明顯改善，損傷區(qū)皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少。
　　第二部分:
　　1.HBO

7、連續(xù)治療3-10d腦損傷大鼠神經(jīng)功能明顯改善。
　　2.與TBI組相比，TBI+HBO組HBO治療后術(shù)后1d、2d、3d腦含水量明顯下降，HBO治療可以減輕腦水腫。
　　3.Real-time PCR檢測(cè)顯示，與TBI組相比，TBI+HBO組術(shù)后1d、3d、7d和10d損傷區(qū)皮層CCL2 mRNA和CCR2 mRNA表達(dá)均顯著下降。
　　4.Western blot法檢測(cè)顯示，TBI后1-10 d損傷區(qū)皮層CCR2蛋白

8、含量與Sham組相比均增高，術(shù)后3 d CCR2蛋白含量較Sham組增加了2.37倍。與TBI組相比，經(jīng)HBO治療后，TBI+HBO組術(shù)后3d和7 d CCR2蛋白含量均明顯下降。
　　5.Western blot法檢測(cè)顯示， TBI術(shù)后1-10d損傷皮層caspase-3蛋白含量與Sham組相比均顯著增高，TBI后1 d caspase-3蛋白含量較Sham組增加了3.29倍。經(jīng)HBO治療后，與TBI組相比，TBI+HBO組術(shù)后