人多能性干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究.pdf

1、第一章攜帶生殖細(xì)胞特異基因熒光報(bào)告系統(tǒng)的人類胚胎干細(xì)胞系的構(gòu)建和誘導(dǎo)分化研究
　　 目的：構(gòu)建攜帶生殖細(xì)胞特異基因VASA熒光報(bào)告系統(tǒng)的人胚胎干細(xì)胞穩(wěn)定系，利用穩(wěn)定系優(yōu)化生殖細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的體系。
　　 方法：通過慢病毒感染的方法構(gòu)建chHES137-VASA-EGFP熒光報(bào)告基因細(xì)胞系，并進(jìn)一步使用單克隆法篩選具有相同基因型的亞系。利用構(gòu)建成功的細(xì)胞系進(jìn)行向原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究。挑取傳代后d5～6天完全未分化的

2、chHES137-VASA-EGFP克隆制備擬胚體(EB)。在Wnt3a(30ng/ml)和BMP4(100ng/ml)聯(lián)合作用下誘導(dǎo)EBs向原始生殖細(xì)胞分化。取誘導(dǎo)分化后d12誘導(dǎo)細(xì)胞作流式分析EGFP陽性細(xì)胞群，并分選收集EGFP陽性細(xì)胞和EGFP陰性細(xì)胞，進(jìn)行生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的RT-PCR檢測和VASA原位染色。進(jìn)一步，利用以上構(gòu)建成功細(xì)胞系比較不同誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)基對誘導(dǎo)分化效率的影響。
　　 結(jié)果：chHES137-V

3、ASA-EGFP在誘導(dǎo)過程中有綠色熒光蛋白表達(dá)。FACS檢測誘導(dǎo)第12天細(xì)胞的EGFP陽性率為9.8±0.2，生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因VASA、DAZL和SCP3在流式分選后EGFP陽性細(xì)胞中均有表達(dá)，EGFP陰性細(xì)胞中均未見表達(dá)。誘導(dǎo)第12天細(xì)胞的原位染色顯示表達(dá)EGFP綠色熒光的細(xì)胞與VASA抗體標(biāo)記的紅色熒光細(xì)胞有部分重疊，提示EGFP綠色熒光的區(qū)域即為細(xì)胞內(nèi)源性VASA表達(dá)部位。FACS檢測不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基體系下生殖細(xì)胞的分化效率，D

4、/F12-EB組EGFP陽性率為9.7±1.2，明顯高于其它三種培養(yǎng)體系，并且生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因在D/F12-EB組有表達(dá)，其它組表達(dá)不明顯。
　　 結(jié)論：構(gòu)建的chHES137-VASA-EGFP報(bào)告細(xì)胞系能有效示蹤體外誘導(dǎo)分化過程中的原始生殖細(xì)胞。D/F12-EB基礎(chǔ)培養(yǎng)基較其它培養(yǎng)基更能支持生殖細(xì)胞的體外分化，Wnt3a和BMP4能有效促進(jìn)原始生殖細(xì)胞的形成。
　　 第二章卵巢早衰的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(POF-iP

5、S)、正常的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(hEFs-iPS)和人胚胎干細(xì)胞向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的比較研究
　　 目的：構(gòu)建POF-iPS、hEFs-iPS的VASA-EGFP熒光報(bào)告細(xì)胞系，比較其與chHES137-VASA-EGFP向生殖細(xì)胞分化能力的差異。
　　 方法：通過慢病毒感染的方法構(gòu)建攜帶生殖細(xì)胞特異標(biāo)記的POF-iPS-VASA-EGFP和hEFs-iPS-VASA-EGFP穩(wěn)定系。運(yùn)用chHES137-VASA-EGF

6、P向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的體系，比較POF-iPSVASA-EGFP、hEFs-iPS-VASA-EGFP和chHES137-VASA-EGFP三株不同細(xì)胞系向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力的差異。收集第12天誘導(dǎo)細(xì)胞，F(xiàn)ACS檢測誘導(dǎo)效率。
　　 結(jié)果：POF-iPS-VASA-EGFP、hEFs-iPS-VASA-EGFP和chHES137-VASA-EGFP在向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的過程中均有綠色熒光蛋白表達(dá)。三株細(xì)胞系誘導(dǎo)效率有差異，PO