臍帶基質(zhì)干細胞的分離、鑒定及其向生殖細胞分化的研究.pdf

1、目的:傳統(tǒng)理論均認為人卵母細胞是不可再生細胞，免疫、環(huán)境、遺傳等多種因素及婦科腫瘤的疾病進展、治療過程均可損害卵母細胞、導致卵巢功能明顯降低，甚至衰竭，喪失生育功能，在神經(jīng)、骨骼、內(nèi)分泌等多方面影響女性的身心健康。這一類患者即使通過輔助生殖技術(shù)也無法獲得有功能的卵子。因此，獲得再生卵母細胞，是真正有助于解決這類患者無法生育及恢復其生殖-內(nèi)分泌功能的重要途徑。
　　近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，干細胞具備發(fā)育全能性，在一定條件下于體內(nèi)或體

2、外均可誘導分化為功能細胞。有關(guān)胚胎干細胞的研究發(fā)現(xiàn):胚胎原始生殖細胞經(jīng)體外培養(yǎng)及體內(nèi)移植可產(chǎn)生有功能的卵母細胞和精子，并成功生育子代。但胚胎干細胞無法做到自體移植，取材不便、有致瘤性等諸多問題使其研究受到限制。因此，人們將研究重點轉(zhuǎn)向成體干細胞。其中臍帶基質(zhì)干細胞(Umbilical cord mesenchymal stemcells，UCMSCs)，來源于新生兒臍帶，不需要任何侵入性的過程就可以在廢棄的臍帶當中獲取它，不存在倫理學爭

3、議等優(yōu)勢，均使其成為再生卵母細胞的重要種子來源。根據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)，該細胞具有分化為卵母樣細胞的潛能，可表達原始生殖細胞標記物，且能在卵巢局部存活并生長。但均尚未獲得功能性配子。究其原因，與體外使用卵巢卵泡液等誘導方式尚無法完全模擬體內(nèi)微環(huán)境有關(guān)。
　　研究顯示性腺來源的體細胞更有助于生殖細胞分化，且同步化的卵巢體細胞才能促進原始生殖細胞(Primordial germ cell，PGCs)進一步減數(shù)分裂。由此我們認為減數(shù)分裂前期

4、的胚胎卵巢與干細胞進行共培養(yǎng)，有望更好地模擬體內(nèi)卵巢卵子發(fā)生的微環(huán)境，同時充分利用卵巢細胞分泌細胞因子等微環(huán)境對干細胞進行環(huán)境誘導，可能更有助于觀察卵巢微環(huán)境在卵子發(fā)生中的作用，探索成體干細胞向生殖細胞分化的可能機制。因此我們擬對UCMSCs進行分離培養(yǎng)及鑒定，再與原始生殖細胞共培養(yǎng)，誘導UCMSCs向卵母細胞樣細胞進行分化，探索其體外誘導生殖細胞的可能機制，為完全卵母細胞再生的研究提供思路。
　　方法:1.1 UCMSCs的分離

5、培養(yǎng)及鑒定
　　采用機械分離方法提取新生兒臍帶膠質(zhì)、進行剪碎后行組織塊直接貼壁培養(yǎng)UCMSCs，運用流式細胞學技術(shù)檢測UCMSCs的免疫表型，進行干細胞鑒定，將P3代UCMSCs作為種子細胞。
　　1.2 PGCs的分離培養(yǎng)及鑒定
　　采用機械分離12.5dpc（days posteoltum，發(fā)現(xiàn)陰栓的當天記為0.5dpc）的Balb/c小鼠的胎鼠生殖嵴，剪碎后行組織塊直接貼壁培養(yǎng)PGCs，運用AP染色初步鑒定細胞、

6、運用流式細胞學技術(shù)檢測P3代PGCs的免疫表型，進一步進行細胞鑒定。
　　1.3 PGCs的生物學特性研究
　　取P3代PGCs，細胞免疫熒光染色，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)等技術(shù)進行PGCs的生物學特性研究。
　　1.4 誘導UCMSCs向原始生殖細胞樣細胞(Primordial germ cell-like cells，PGCLCs)分化及鑒定
　　取P3代UCMSCs，實驗組使用PGCLCs誘導培養(yǎng)

7、液培養(yǎng)，對照組繼續(xù)使用UCMSCs培養(yǎng)液，采取置于37℃，5％ CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，隔日換液，并觀察培養(yǎng)液有無渾濁。及倒置顯微鏡下對照兩組細胞形態(tài)變化。運用流式細胞學技術(shù)檢測誘導分化后UCMSCs的免疫表型鑒定。
　　1.5 共培養(yǎng)誘導分化UCMSCs
　　取PGCLCs+P0代PGCs為實驗組1，P4代UCMSCs+P0代PGCs為實驗組2，P4代UCMSCs+ P4代UCMSCs為對照組，均利用0.4μm孔徑的Tra

8、nswell小室共培養(yǎng)，置于37℃，5％ CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，隔日換液，并觀察培養(yǎng)液有無渾濁。
　　1.6 Western blot檢測UCMSCs向卵母細胞分化情況
　　取共培養(yǎng)14d后的UCMSCs進行Western blot檢測SCP3表達情況，評估其向卵母細胞的分化情況。
　　1.7 統(tǒng)計學分析
　　統(tǒng)計學分析應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以(x)±s表示，組間比較采用單因素x2檢驗，P＜0.

9、05為差異。
　　結(jié)果:2.1 UCMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定
　　倒置顯微鏡下觀察組織塊貼壁培養(yǎng)3-5天后開始有少量長梭形細胞爬出，培養(yǎng)7d后細胞融合達90％，呈漩渦狀或者平行排列貼壁生長，雜細胞較少，傳代后細胞較均一，形態(tài)規(guī)則，呈長梭形，增殖快，常于傳代后2d再次接近融合狀態(tài)。流式細胞學技術(shù)檢測UCMSCs表達中胚層來源分子CD73及分子CD29，陽性率分別為62.9％、95.5％，表達內(nèi)皮細胞特征分子CD31，陽性率為0

10、.221％，表達造血干細胞系特征分子CD45，陽性率為0.186％，表達階段特異性胚胎抗原SSEA-1，陽性率為0.946％，符合UCMSCs的特征。
　　2.2 PGCs的分離培養(yǎng)及鑒定
　　倒置顯微鏡下觀察生殖嵴組織塊3-5天開始爬出貼壁細胞，5-7天細胞能生長至70％～80％融合，細胞輪廓清楚，排列緊密，大部分細胞形態(tài)為核質(zhì)比較大的圓形或者橢圓形細胞。至80％左右融合狀態(tài)時進行傳代，傳代后細胞增殖迅速，常于傳代后3天再

11、次接近融合狀態(tài)。AP染色細胞持續(xù)陽性，表明為含有堿性磷酸酶活性陽性的胚胎原始生殖細胞。流式細胞學技術(shù)檢測PGCs表達階段特異性胚胎抗原SSEA-1，陽性率為92.5％，表達階段特異性胚胎抗原SSEA-4，陽性率為0.71％，符合小鼠PGCs的特征。
　　2.3 PGCs的生物學特性研究
　　通過細胞免疫熒光染色及RT-PCR檢測可發(fā)現(xiàn)，Oct4、Stra8、Vasa、Scp3、Zp3均為陽性表達，表明我們所培養(yǎng)的PGCs是一

12、種來自小鼠胚胎早期的胚胎生殖細胞，處于未分化狀態(tài)，而且在體外培養(yǎng)過程中可進入減數(shù)分裂Ⅰ期。
　　2.4 誘導UCMSCs向PGCLCs分化及鑒定
　　倒置顯微鏡下觀察實驗組:經(jīng)過向PGCLCs誘導7d-9d后，開始出現(xiàn)部分核質(zhì)比大的圓形或橢圓形細胞，對照組細胞仍然保持長梭形形態(tài)。貼壁培養(yǎng)14d后，實驗組細胞穩(wěn)定表達階段特異性胚胎抗原SSEA-1，陽性率為73.83％，且表達階段特異性胚胎抗原SSEA-3，陽性率為66.66％

13、，對照組細胞表達階段特異性胚胎抗原SSEA-1及SSEA-3，陽性率分別為0.69％、0.45％，證明實驗組細胞已部分向PGCLCs分化。
　　2.5 Western blot檢測UCMSCs向卵母細胞分化情況
　　結(jié)果顯示，共培養(yǎng)14d后，實驗組1的SCP3蛋白表達水平為0.566622±0.008407，實驗組2的SCP3蛋白表達水平為0.271562±0.041784，對照組的SCP3蛋白表達水平為0.130108±0