人胚胎干細(xì)胞向生殖細(xì)胞定向分化與調(diào)控.pdf

1、目的:采用不同培養(yǎng)基和飼養(yǎng)層培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞系H1，探討適合細(xì)胞增殖的最佳條件并分析其基本生物學(xué)特性，同時探討提高細(xì)胞復(fù)蘇存活率方法，并探討H1是否具有分化為生殖細(xì)胞的潛能。 方法:以人胚胎干細(xì)胞系H1為研究對象，分別采用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF(Mouse embryonic fibroblast，MEF)和人胚胎來源的成纖維細(xì)胞系HFF-1(Human fetal fibroblast，HFF-1)作為飼養(yǎng)層，培養(yǎng)基分別以D

2、MEM/F12和Knock-out<'TM> DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制H1培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)共分為四組：Ⅰ MEF+DMEM/F12，Ⅱ MEF4-K-DMEM，ⅢHFF4-DMEM/F12，ⅣHFF+K-DMEM。細(xì)胞復(fù)蘇采用H1培養(yǎng)基中添加存活因子BDNF、NT3和NT4(統(tǒng)稱NTs)，成為復(fù)蘇條件培養(yǎng)基。H1基本生物學(xué)特性檢測采用免疫熒光、RT-PCR、堿性磷酸酶和核型分析，同時檢測未分化H1的生殖細(xì)胞分化相關(guān)基因的基本表達(dá)模式，分別

3、以人正常睪丸組織和人胚胎成纖維細(xì)胞株HFF-1作為陽性和陰性對照組織。 結(jié)果:Ⅰ組中H1克隆形態(tài)規(guī)則，不發(fā)生分化，增殖速度快；而Ⅱ組細(xì)胞克隆傳代后第四天發(fā)生分化：Ⅲ組和Ⅳ組細(xì)胞傳代后第三關(guān)就顯示出分化趨勢，克隆變扁。采用復(fù)蘇條件培養(yǎng)液復(fù)蘇細(xì)胞后，與常規(guī)復(fù)蘇方法相比，克隆存活率明顯提高。Ⅰ組中H1細(xì)胞保持正常核型和基本生物學(xué)特性。未分化H1表達(dá)減數(shù)分裂前生殖細(xì)胞標(biāo)志基因STELLAR，DAZL，F(xiàn)RAGILISPUM1，PUM2和

4、GDF3；不表達(dá)原始生殖細(xì)胞標(biāo)志BLIMP-1、減數(shù)分裂特異標(biāo)志SCP1、減數(shù)分裂啟動標(biāo)志STRA8以及生殖細(xì)胞分化后期標(biāo)志VASA。 結(jié)論:不同的hES細(xì)胞系最佳培養(yǎng)條件是不同的；Ⅰ組培養(yǎng)條件適合H1細(xì)胞增殖，而HFF-1不能有效維持H1細(xì)胞生長；復(fù)蘇細(xì)胞可添加存活因子以提高克隆存活率。未分化H1細(xì)胞表達(dá)生殖細(xì)胞減數(shù)分裂前標(biāo)志基因，但不表達(dá)分化后期標(biāo)志基因，提示人胚胎干細(xì)胞本質(zhì)上是一種異質(zhì)性細(xì)胞群，與原始生殖細(xì)胞PGCs(Pr