人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞向男性生殖細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化的研究.pdf

1、【背景與目的】男性不育的發(fā)病率越來(lái)越高，據(jù)統(tǒng)計(jì)已達(dá)到所有育齡夫婦的15％，其中40%-60%是由于男性精子發(fā)生異?；蛘系K，目前人工授精的方式不能滿足所有患者的需要，如何才能讓患者獲得遺傳學(xué)上屬于自己的后代成為目前研究的熱點(diǎn)。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells,HuMSCs)來(lái)源于胚外中胚層，是一種能夠向多個(gè)方向分化的成

2、體干細(xì)胞,且具有取材方便、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，我們的前期研究表明，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（HuMSCs）在新生小鼠睪丸細(xì)胞培養(yǎng)液、維甲酸及睪酮的誘導(dǎo)培養(yǎng)下，誘導(dǎo)第7天形態(tài)上開(kāi)始變細(xì)變長(zhǎng)，形成類(lèi)似“蝌蚪樣”細(xì)胞，第3、7天表達(dá)生殖細(xì)胞標(biāo)記OCT4、Ckit、CD49f、Stella，第14天表達(dá)生殖細(xì)胞特異標(biāo)記DDX4；將 HuMSCs移植至不育小鼠睪丸曲細(xì)精管內(nèi)，1個(gè)月后能夠表達(dá)生殖細(xì)胞標(biāo)記Stella、Dazl，移植后不發(fā)生排斥反應(yīng)，且可發(fā)

3、生遷移并能存活至少120天。但是誘導(dǎo)得到的細(xì)胞無(wú)法進(jìn)一步誘導(dǎo)分化成為有功能的成熟的男性生殖細(xì)胞。目前國(guó)內(nèi)外科學(xué)家也未能將成體干細(xì)胞成功誘導(dǎo)分化為有功能的生殖細(xì)胞，推測(cè)可能與成體干細(xì)胞分化潛能不足有關(guān)。2006年，日本京都大學(xué)Yamanaka研究小組首次將攜帶Oct4、Sox2、Klf4、c-myc的逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF)，獲得了在形態(tài)學(xué)、基因表達(dá)、表面抗原以及分

4、化潛能等方面和胚胎干細(xì)胞十分相似的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。此后，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別重編程出人和其他物種的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，且通過(guò)使用小分子物質(zhì)、蛋白質(zhì)以及microRNA或者通過(guò)基因敲剪等方法提高了重編程效率，2008年，Liao等人利用OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、LIN28、NANOG六因子，成功將人皮膚成纖維細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞，且重編程效率

5、達(dá)到1.6%左右，2010年，Cai等人利用逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc四因子將HuMSCs成功重編程為iPS細(xì)胞，但是效率較低下，僅0.4%細(xì)胞被重編程。IPS細(xì)胞的出現(xiàn)，不僅擺脫了胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)面臨的倫理與免疫排斥問(wèn)題，而且具有向三胚層分化的潛能，理論上可以向生殖細(xì)胞方向分化。目前，生殖細(xì)胞的誘導(dǎo)仍是一個(gè)世界性難題,僅小鼠ES細(xì)胞能夠誘導(dǎo)出可育配子，人類(lèi)E

6、S細(xì)胞及iPS細(xì)胞體外經(jīng)藥物誘導(dǎo)誘導(dǎo)或DAZL基因家族過(guò)表達(dá)能夠較低效率地產(chǎn)生早期原始生殖細(xì)胞和減數(shù)分裂后的單倍體細(xì)胞，利用小鼠精原干細(xì)胞條件培養(yǎng)基加上各種誘導(dǎo)劑也能夠讓 ES細(xì)胞突破減數(shù)分裂，但是這些方法均無(wú)法形成有功能的人類(lèi)生殖細(xì)胞，誘導(dǎo)效率都非常低下，而且ES細(xì)胞面臨取材和倫理及免疫排斥等諸多問(wèn)題，影響了其臨床應(yīng)用。除人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM

7、SCs)也能在體外誘導(dǎo)也獲得了早期生殖細(xì)胞，但是不能突破減數(shù)分裂，誘導(dǎo)獲得的生殖細(xì)胞僅能檢測(cè)了生殖細(xì)胞早期基因，如：DDX4、DPPA3、CD49f、DAZL等，不能檢測(cè)到生殖細(xì)胞減數(shù)分裂期以及減數(shù)分裂后期的基因表達(dá),如SYCP3、PRM1等。而iPS細(xì)胞能夠經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)往男性生殖細(xì)胞方向分化，表達(dá)晚期生殖細(xì)胞標(biāo)記，如SYCP3、PRM1等，并且能夠突破減數(shù)分裂形成單倍體細(xì)胞。說(shuō)明iPS細(xì)胞具有和ES細(xì)胞相似的分化潛能，而且避免了ES細(xì)胞面

8、臨的法律與倫理問(wèn)題。因此，iPS細(xì)胞是目前最理想的自體細(xì)胞治療的種子細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合 HuMSCs及iPS細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)，利用慢病毒載體將OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、NANOG和LIN28六個(gè)轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入 HuMSCs，將 HuMSCs重編程為 iPS細(xì)胞，再用 Bone morphogenetic protein4(BMP4)將iPS細(xì)胞向男性生殖細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化。
　　【材料與方法】采用貼壁法分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增出人臍帶

9、間充質(zhì)干細(xì)胞；利用攜帶OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、LIN28和NANOG六因子質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，用293FT細(xì)胞包裝攜帶上述六因子的慢病毒；再用慢病毒感染HuMSCs，將HuMSCs重編程為iPS細(xì)胞,挑取形態(tài)良好的克隆進(jìn)行傳代建系,并通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、核型分析、堿性磷酸酶染色、多能基因 RT-PCR、ES特異性蛋白免疫熒光、體外擬胚體（embryoid body，EB）形成和體內(nèi)畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)對(duì)iPS細(xì)胞的鑒定。鑒

10、定完成后，挑選完全重編程的iPS細(xì)胞，在體外經(jīng)EB（embryoid body）形成的方法，將其中一株iPS細(xì)胞（HuMSC- iPS1）向男性生殖細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化。EB形成后第一天（D0），向?qū)嶒?yàn)組EB培養(yǎng)基中加入BMP4（100ng/ml），對(duì)照組（自發(fā)分化組）繼續(xù)用 EB培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其自發(fā)分化。分別于不同時(shí)間點(diǎn)（D0、D3、D7和D10）顯微鏡觀察BMP4誘導(dǎo)組和自發(fā)分化組EB的形態(tài)學(xué)差異；RT-qPCR檢測(cè)生殖細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記（D

11、DX4、SYCP3和PRM1）表達(dá)量變化(以誘導(dǎo)前即D0的表達(dá)量為基礎(chǔ)表達(dá)量，不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均與基礎(chǔ)表達(dá)量相比)；細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)生殖細(xì)胞早期標(biāo)記 DDX4和減數(shù)分裂相關(guān)標(biāo)記SYCP3。
　　【結(jié)果】OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、LIN28和NANOG六因子感染后第十天就有形態(tài)各異的細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)，感染后第十四天挑取細(xì)胞團(tuán)傳代建系。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、多能基因RT-PCR、細(xì)胞核型分析、堿性磷酸酶染色、ES特異性蛋白免疫熒光

12、、體內(nèi)畸胎瘤形成和體外擬胚體形成等實(shí)驗(yàn)鑒定我們獲得的iPS細(xì)胞具有與ES細(xì)胞類(lèi)似的特性；重編程效率約為1.25%。獲得的iPS細(xì)胞能夠在 BMP4（100ng/ml）誘導(dǎo)下向男性生殖細(xì)胞方向分化，生殖細(xì)胞標(biāo)記DDX4和SYCP3在誘導(dǎo)第七天表達(dá)量最高，分別達(dá)到基礎(chǔ)表達(dá)量的4倍和5倍以上，而生殖細(xì)胞晚期標(biāo)記PRM1的表達(dá)量在誘導(dǎo)第十天（D10）達(dá)到最高，達(dá)到基礎(chǔ)表達(dá)量的3倍以上。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明：在誘導(dǎo)第七天（D7），BMP4誘導(dǎo)組和