體外誘導(dǎo)生成人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞及向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的研究.pdf

1、研究背景:目前針對(duì)肝衰竭的治療手段中最有效的為肝臟移植治療，但由于供體的嚴(yán)重短缺，無(wú)法進(jìn)行普遍推廣。人工肝支持系統(tǒng)可以暫時(shí)替代肝臟功能，幫助病人渡過肝衰竭危險(xiǎn)期等待肝細(xì)胞再生，或維持病人生存至得到合適的供體進(jìn)行肝移植。生物人工肝是目前認(rèn)為最理想的人工肝，但其發(fā)展受限于肝細(xì)胞來(lái)源問題。干細(xì)胞由于具有轉(zhuǎn)化為各種類型組織細(xì)胞的能力，可能為人工肝治療的肝細(xì)胞新的來(lái)源。胚胎干細(xì)胞可具有良好的多潛能性，可分化為多種人體組織細(xì)胞，但其應(yīng)用受到倫理學(xué)的

2、限制。自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和外周血干細(xì)胞獲取數(shù)量有限，難以建立細(xì)胞系，不能滿足生物型人工肝所需要擴(kuò)增的數(shù)量及也不夠穩(wěn)定。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞同樣，具有自我更新、增殖和分化的特性，卻避免了應(yīng)用胚胎干細(xì)胞研究所需要面臨的倫理問題和法律問題，可以避免目前常用的異種及腫瘤肝細(xì)胞應(yīng)用于生物人工肝的主要缺點(diǎn)，可能成為治療終末期肝衰竭新的肝細(xì)胞來(lái)源，其臨床應(yīng)用將具有廣闊的前景。
　　目的:將人包皮成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為ips細(xì)胞，進(jìn)一步誘導(dǎo)為

3、肝細(xì)胞樣細(xì)胞，為人工肝支持治療提供新的肝細(xì)胞來(lái)源。
　　方法:以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體將Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc因子導(dǎo)入人包皮成纖維細(xì)胞中，在體外應(yīng)用hES細(xì)胞專用培養(yǎng)體系，培養(yǎng)病毒感染后體細(xì)胞，促使其誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞。進(jìn)一步通過AP染色、免疫熒光染色，核型鑒定、類胚體形成、臍胎瘤形成等實(shí)驗(yàn)鑒定所誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞具有類似ES細(xì)胞的全能性。對(duì)實(shí)驗(yàn)中所獲得的ips細(xì)胞，在體外經(jīng)加入不同的刺激因子，誘導(dǎo)ips細(xì)胞先分化為內(nèi)胚層

4、細(xì)胞，進(jìn)而分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞。誘導(dǎo)過程中各階段的標(biāo)志物經(jīng)免疫熒光染色及流式染色驗(yàn)證分化效率。獲得的肝細(xì)胞樣細(xì)胞經(jīng)Elisa方法檢測(cè)ALB的分泌量，PAS染色檢測(cè)糖原貯存功能，RT-PCR及Real-time PCR檢測(cè)特異性基因的表達(dá)。誘導(dǎo)的ips細(xì)胞經(jīng)熒光標(biāo)記后經(jīng)尾靜脈注射入急性肝損傷的C57小鼠體內(nèi)，了解ips細(xì)胞是否對(duì)肝損傷有治療作用。
　　結(jié)果:成功從人包皮成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)出ips細(xì)胞，鑒定其有類似ES細(xì)胞的多潛能性，對(duì)實(shí)驗(yàn)