補腎中藥誘導小鼠胚胎干細胞向生殖細胞方向分化的研究.pdf

1、【目的】
　　研究補腎中藥單體及復方含藥鼠血清誘導小鼠胚胎干細胞定向分化為卵母細胞的影響。
　　【方法】
　　1、實驗一補腎中藥單體齊墩果酸對mESC定向誘導的方法
　　選擇R1/E、1B10和D3三種不同小鼠品系小鼠胚胎干細胞（mESC）為實驗對象，誘導mESC形成擬胚體（EB），以終濃度齊墩果酸分別干預三組EB分化，維甲酸為陽性對照組，二甲基亞砜為空白對照組，于37℃、5％ CO2條件下培養(yǎng)，鏡下觀察細胞形態(tài)

2、學變化。3d后提取細胞RNA，合成cDNA，利用實時定量基因擴增熒光法（qPCR）檢測三種細胞各組生殖分化相關的基因Oct4、Gdf9、Scp3、Mvh、Zp1、Zp2、Zp3表達水平的變化；
　　2、實驗二補腎中藥復方含藥血清對mESC定向誘導的方法
　　選擇1B10為實驗對象，誘導mESC形成EB，以終濃度5%1＃、2＃、3＃、5＃、10＃含藥血清干預EB，以5%空白血清作為對照，以control組（即無血清添加）為空白

3、對照。于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每3天換液，收集各組細胞，鏡下觀察細胞形態(tài)學改變。鏡下觀察mESC形態(tài)變化時行細胞免疫熒光實驗，驗證含藥鼠血清干預后的細胞是否具有GDF9、SCP3、ZP3三種卵母細胞標識蛋白的表達；利用qPCR檢測定量觀察含藥鼠血清干預后第3、5、8、11天細胞內基因Oct4、Nanog、Prdm14、Blimp1、Tfap2c、Gdf9、Scp3、Zp3的表達；同時運用雙抗體免疫酶聯反應法（ELISA）測定含

4、藥鼠血清干預后每5、8、11、14天細胞內生殖細胞標志物GDF9、SCP3、ZP3含量的變化。
　　以上實驗數據均使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，若數據滿足正態(tài)分布及方差齊性，則采用_x±s表示，運用卡方檢驗進行檢測。
　　【結果】
　　1、實驗一結果
　　與DMSO組相比較，齊墩果酸單體可上調R1/E中Scp3、Mvh、Zp1、Zp2基因表達（P＜0.01），上調1B10中Gdf9、Mvh、Zp2、Zp3基因

5、表達（P＜0.05）以及D3中Oct4、Gdf9、Scp3、Mvh、Zp1、Zp3基因表達（P＜0.05），促使R1/E、1B10及D3向生殖細胞方向分化；與DMSO組相比較，陽性參照物維甲酸單體僅能上調R1/E中Mvh基因表達（P＜0.01）以及1B10中Gdf9、Mvh、Zp3基因表達（P＜0.01），而D3中各生殖基因表達均明顯下調。
　　2、實驗二結果
　　2.1五組含藥血清組，空白血清組及control組鏡下觀察均

6、可見分化后的mESC出現卵母細胞樣形態(tài)學改變；
　　2.2各補腎中藥含藥鼠血清干預EB后，類卵細胞均能表達卵母細胞標志物GDF9、ZP3及減數分裂標志物SCP3，而空白血清組和control組則未能表達；
　　2.3五組含藥血清組均與空白血清組相比較，1＃含藥鼠血清干預EB后，在分化3d時Prdm14、Blimp1、Tfap2c、Scp3基因表達明顯上調（P＜0.01）；3＃、5＃、10＃含藥鼠血清組于分化5-8d時Gdf9

7、、Scp3、Zp3基因表達上調（P＜0.05）進入分化活躍期；2＃含藥鼠血清在分化8d時各基因表達上調并出現峰值，可顯著促進基因Prdm14、Blimp1、Gdf9、Scp3表達上調（P＜0.01），五組含藥血清組均隨干預時間延長而各基因表達不同程度下降；
　　2.4與空白血清組相比較，不同時間段對細胞內GDF9、SCP3、ZP3的蛋白含量測定顯示，除2＃含藥血清組于5d時細胞內GDF9蛋白含量減少（P＜0.05）；1＃含藥血清組

8、于8d，2＃含藥血清組于8、11、14d時細胞內 SCP3含量減少（P＜0.01）；3＃含藥血清組全程，5＃含藥血清組于14d時細胞內ZP3蛋白含量增加（P＜0.01）外，余各組三種蛋白含量均無顯著差異。
　　【結論】
　　1、補腎中藥單體及復方含藥血清均可定向誘導mESC向早期卵母細胞方向分化。
　　2、齊墩果酸單體定向誘導起效迅速但細胞凋亡較快，不適宜長期體外干預；補腎中藥含藥鼠血清起效較緩但作用穩(wěn)定，更具有臨床意