小鼠睪丸支持細胞誘導小鼠胚胎干細胞向生殖細胞分化的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的:胚胎干細胞(ESC)具有全能性，能夠分化成一個完整生命個體所需之各式各樣的不同的細胞。ES細胞定向誘導分化是目前國際上研究的熱點，其中ES細胞向生殖細胞的分化是一個非常新的領(lǐng)域。近年來，在移植研究中用原始生殖細胞(PGC)和生殖干細胞(GSC)來改善生育已經(jīng)取得了不同程度的成功，這使研究者們把研究深度進一步加深，用ES細胞作為生殖細胞分化的起始點。到目前為止，共有五個實驗室分化成功。這五個實驗室都是先將胚胎干細胞分化成類

2、胚體(EB)，EBs包含早期胚胎典型的組織系統(tǒng)，再加一些誘導劑或條件培養(yǎng)基或者只是讓細胞自發(fā)分化，一段時間之后可以檢測到生殖細胞標志分子的表達。本研究是將小鼠睪丸支持細胞與ES細胞共培養(yǎng)，支持細胞與ES細胞形成細胞間接觸，同時支持細胞還可以分泌一些細胞因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-4)，在這兩種因素的作用下，誘導ES細胞向生殖細胞分化，目的在于用模擬體內(nèi)的微環(huán)境來誘導ES細胞分化成生殖細胞。我們將小鼠睪丸支持細胞與ES細胞共培養(yǎng)，在一定

3、的時間點用RT-PCR，原位雜交，免疫組化和Western-Blotting檢測生殖細胞標志分子的表達；其中鼠vasa同源體(Mvh)的表達有力證實了小鼠ES細胞分化成生殖細胞。通過該研究，我們用模擬體內(nèi)的微環(huán)境誘導ES細胞分化成生殖細胞，建立一種相對穩(wěn)定的體外分化系統(tǒng)，有助于分析生殖細胞分化過程中的基因演變和外遺傳的程序重調(diào)，有助于核轉(zhuǎn)移技術(shù)的發(fā)展和不育治療。 第一部分小鼠睪丸支持細胞的分離培養(yǎng)與鑒定 方法：取18～2

4、0天雄性ICR小鼠的睪丸，酶消化法原代培養(yǎng)。用RT-PCR的方法克隆帶有鋅指結(jié)構(gòu)域的支持細胞基因(SERZ)，與pcDNA3.0連接后構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.0-SERZ。用KpnⅠ和XbaⅠ分別酶切質(zhì)粒pcDNA3.0-SERZ，獲得線性化模板進而合成探針。原位雜交檢測SERZmRNA在培養(yǎng)的細胞中的表達；用RT-PCR的方法檢測雄激素結(jié)合蛋白(ABP)在支持細胞中的表達。另外，支持細胞在電鏡下有特征性結(jié)構(gòu)，對細胞進行電鏡拍照觀察。

5、結(jié)果：光鏡下，支持細胞多為多邊形，細胞完全鋪開，成膜狀，相鄰細胞之間交織連接。電鏡下，支持細胞的核呈三角形或不規(guī)則形，染色淺，核仁明顯，胞質(zhì)內(nèi)細胞器比較豐富，糖原、脂滴、溶酶體和線粒體較多，相鄰細胞之間形成緊密連接。原位雜交檢測結(jié)果顯示SERZmRNA在培養(yǎng)細胞的胞漿中高水平表達。RT-PCR結(jié)果表明我們分離的支持細胞能夠表達ABPmRNA。結(jié)論：我們成功分離和鑒定了小鼠睪丸支持細胞，純度在85％以上，為以下的實驗提供了準確、有效的實驗

6、工具。 第二部分小鼠睪丸支持細胞對小鼠ES細胞的定向誘導分化 方法：將小鼠睪丸支持細胞與小鼠ES細胞共培養(yǎng)(共培養(yǎng)組)，同時設(shè)ES細胞單獨培養(yǎng)組(自發(fā)分化組)和小鼠睪丸支持細胞條件培養(yǎng)基誘導組(條件培養(yǎng)基誘導組)作為對照。3d和7d后分別收集細胞，做流式分選(FACS)，利用ES細胞帶有綠色熒光蛋白(GFP)標記從而發(fā)綠色熒光的特性將ES細胞與小鼠睪丸支持細胞分開。分選完后，一部分細胞抽提總RNA，利用特異的引物檢測Mv

7、h，DAZL，Mil-2，Oct-4和c-Kit這些細胞因子mRNA的表達，以β-actin作為內(nèi)參照；一部分細胞裂解后進行SDS-PAGE凝膠電泳，Western-Blotting檢測SSEA-1的表達水平；一部分細胞做成細胞涂片，免疫組化檢測SSEA-1的表達，原位雜交檢測Mvh的表達。結(jié)果：RT-PCR檢測到三天共培養(yǎng)組中生殖細胞的標志物Mvh，DAZL，Mil-2，Oct-4和c-Kit的表達，七天共培養(yǎng)組中Mvh，DAZL，M

8、il-2和c-Kit的表達略有增加，Oct-4的表達略有下降。同時RT-PCR也分別檢測到三天條件培養(yǎng)基誘導組和自發(fā)分化組中生殖細胞的標志物Mvh，DAZL，Mil-2，Oct-4和c-Kit的表達，七天條件培養(yǎng)基誘導組和自發(fā)分化組中Mvh，DAZL，Mil-2和c-Kit的表達分別略有增加，Oct-4的表達分別略有下降。同時間段的基因表達水平進行比較，共培養(yǎng)組中生殖細胞的標志物Mvh，DAZL，Mil-2和c-Kit的表達分別比條件培

9、養(yǎng)基誘導組略高，而條件培養(yǎng)基誘導組又分別比自發(fā)分化組略高；共培養(yǎng)組中Oct-4的表達比條件培養(yǎng)基誘導組略低，而條件培養(yǎng)基誘導組又比自發(fā)分化組略低。免疫組化染色顯示SSEA-1陽性表達。Western-Blotting檢測結(jié)果顯示三天共培養(yǎng)組中SSEA-1表達水平比對照組(ES組)低，七天共培養(yǎng)組中SSEA-1表達水平更低，提示ES細胞已經(jīng)發(fā)生分化。通過原位雜交顯色，在3d共培養(yǎng)組中就可以檢測到Mvh陽性表達的細胞，7d共培養(yǎng)組中Mvh陽

10、性細胞增多，但是陽性率較低，提示ES已經(jīng)向生殖細胞分化，但是分化率不高。結(jié)論：將小鼠睪丸支持細胞與ES細胞共培養(yǎng)，支持細胞與ES細胞形成細胞間接觸，同時支持細胞還可以分泌一些細胞因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-4)，在這兩種因素的作用下，誘導ES細胞向生殖細胞分化；分化率比小鼠睪丸支持細胞條件培養(yǎng)基誘導組和ES細胞自發(fā)分化組略高。說明小鼠睪丸支持細胞與ES細胞共培養(yǎng)，可以模擬體內(nèi)的微環(huán)境從而誘發(fā)ES細胞向生殖細胞方向分化。 結(jié)論1