煙草病毒RT-PCR檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、本文研究了RT-PCR檢測(cè)TMV、CMV和PVY的技術(shù)方法：用保存在本研究室的TMV、CMV和PVY標(biāo)準(zhǔn)毒原，根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒和馬鈴薯Y病毒外殼蛋白基因的序列，人工合成引物，通過(guò)分別做TMV、CMV和PVY的單重RT-PCR，在1％瓊脂糖上電泳，分別能擴(kuò)增出1.44kb、739bp和780bp特異性條帶，通過(guò)回收TMV、CMV的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和序列分析表明，擴(kuò)增的TMV條帶的核苷酸序列與已報(bào)道的TMV核苷酸序

2、列同源性高達(dá)96.6％，擴(kuò)增的CMV條帶的核苷酸序列與已報(bào)道的CMV核苷酸序列同源性高達(dá)96％。表明我們所擴(kuò)增的TMV和CMV條帶是特異性的。 文章進(jìn)行了CMV、TMV和PVY的多重RT-PCR研究，建立了同時(shí)檢測(cè)TMV、CMV和PVY的RT-PCR檢測(cè)體系，當(dāng)兩種病毒復(fù)合侵染和單獨(dú)侵染的樣本混合在一起，再進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，都能在一次PCR反應(yīng)中，同時(shí)能擴(kuò)增出兩種病毒的相應(yīng)特異條帶，當(dāng)三種病毒單獨(dú)侵染的樣本混合在一起，再進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，都

3、能在一次PCR反應(yīng)中，同時(shí)擴(kuò)增出三種病毒的相應(yīng)的特異條帶。對(duì)TMV病毒的靈敏度檢測(cè)可以達(dá)到1.25μg。 從廣東省主要煙區(qū)梅州地區(qū)五華縣和韶關(guān)地區(qū)南雄市，分別采集了煙草植株樣本，通過(guò)采用鑒別寄主反應(yīng)和RT-PCR方法，對(duì)其進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明五華和南雄的煙草樣品中都存在TMV和CMV，未檢測(cè)到PVY。在檢測(cè)樣品中，表現(xiàn)為單獨(dú)TMV陽(yáng)性的樣品占總樣品的33.33％，單獨(dú)CMV陽(yáng)性的樣品占總樣品的22.22％，TMV、CMV都呈陽(yáng)性