豬博卡病毒多重PCR檢測(cè)和分型研究.pdf

1、豬博卡病毒(Porcine bocavirus,PBoV)是無囊膜單鏈線狀DNA博卡病毒屬成員。自2009年在瑞典患斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)豬體內(nèi)被檢測(cè)出后，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，多個(gè)病毒種或基因型被發(fā)現(xiàn)，依據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系可分為G1，G2，G3三個(gè)PBoV基因群組。這一新發(fā)豬病毒引起了各國的普遍關(guān)注，但人們對(duì)其研究仍處于初級(jí)的探索階段，PBoV的檢測(cè)和分型方法并不全面。因此發(fā)展有效和可靠的檢測(cè)技術(shù)對(duì)PBoV流行病學(xué)調(diào)查分析非

2、常重要。在本研究中，分別構(gòu)建了PBoV普通多重PCR和EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法并應(yīng)用于臨床樣品檢測(cè)。
　　本研究中，在對(duì)三個(gè)基因群組基因組序列進(jìn)行同源性分析的基礎(chǔ)上，分別設(shè)計(jì)特異性引物，首先構(gòu)建了一個(gè)普通多重PCR方法用于同時(shí)檢測(cè)和鑒定不同分型的PBoV。此方法可特異地檢測(cè)三個(gè)PBoV基因群組，對(duì)PBoVG1，PBoV G2和PBoV G3檢測(cè)靈敏度分別為1.0×103，4.5×103和3.8×103 copie

3、s/μL，與三個(gè)PBoV基因群組普通單重PCR的靈敏度1.0×103 copies/μL相近。利用新建立的多重PCR檢測(cè)方法來檢測(cè)227個(gè)臨床樣品。PBoV G1，PBoV G2和PBoV G3檢測(cè)陽性率分別為1.3％，2.6%和12.3%。其中三個(gè)基因群組檢測(cè)有混合感染，PBoV G1與 PBoVG3、PBoV G2與PBoV G3及PBoV G1、PBoV G2與PBoV G3混合感染檢出率分別為0.4%、0.9%和0.4%。除在豬

4、糞樣品中多檢測(cè)出一個(gè)PBoV G2陽性外，PBoV基因群組單重PCR結(jié)果與多重PCR結(jié)果相同。
　　建立的基于EvaGreen PBoV單重或多重實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增后經(jīng)熔解曲線分析，三個(gè)基因群組的擴(kuò)增產(chǎn)物均形成特異熔解峰，PBoV G1、PBoV G2和PBoV G3的Tm值分別為81.3±0.34°C，78.2±0.37°C和85.0±0.29°C，各病毒間Tm值間隔在3°C左右，而非靶標(biāo)病毒及空白陰性對(duì)照無特異熔解峰產(chǎn)生，通過

5、Tm差異可區(qū)分鑒定三個(gè)PBoV基因群組，表明建立的方法具有良好的特異性。三個(gè)基因群組EvaGreen單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)靈敏度分別為25copies/μL(PBoV G1)，10 copies/μL(PBoV G2)和25 copies/μL(PBoV G3)；而EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR體系下單個(gè)基因群組的檢測(cè)靈敏度稍有下降，依次為100copies/μL(PBoV G1)、50 copies/μL(PBoV G2)和100

6、 copies/μL(PBoV G3)；三個(gè)基因群組同時(shí)存在時(shí)EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)靈敏度依次為250 copies/μL(PBoV G1)，250copies/μL(PBoV G2)和100copies/μL(PBoV G3)。EvaGreen單重實(shí)時(shí)熒光PCR和EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR的重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)都小于5%，具有較好的重復(fù)性。EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)227個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果為：PBoV G1

7、陽性率為15.0%，PBoV G2的陽性率為25.1%，PBoV G3的陽性率為41.9%，與利用EvaGreen單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的17.2% PBoV G1，29.1% PBoV G2和44.5% PBoV G3陽性率結(jié)果較為一致；其中，PBoV G1與PBoV G2、PBoV G1與 PBoV、G3PBoV G2與PBoV G3及PBoV G1、PBoV G2與PBoV G3混合感染檢出率分別為3.1%、5.7%、13.2%及

8、3.1%。上述結(jié)果表明PBoV在國內(nèi)豬群中較流行。
　　對(duì)PBoV檢測(cè)陽性的樣品進(jìn)行克隆測(cè)序，并將測(cè)得的目的片段序列分別與PBoV全基因組序列或者接近全基因組序列間的核苷酸序列進(jìn)行基因序列比對(duì)、同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。結(jié)果顯示三組PBoV基因群組內(nèi)的同源性比較高，范圍在72.1-100%之間，而基因群組間的核苷酸序列同源性較低為3.2-54.2%，表明將本研究構(gòu)建的普通多重PCR和EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR兩組PBoV檢測(cè)

9、方法選擇的診斷區(qū)區(qū)分PBoV G1、PBoV G2與PBoVG3三個(gè)基因群組的基因分型方法可行且具有代表性，同時(shí)證實(shí)豬群中PBoV具有較高的遺傳多樣性。
　　本研究成功構(gòu)建立了普通多重PCR和EvaGreen多重實(shí)時(shí)熒光PCR兩組PBoV檢測(cè)和分型方法，可以滿足不同調(diào)查和研究的檢測(cè)需求，這兩組多重PCR檢測(cè)方法能最大限度地節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，提高工作效率，適合養(yǎng)豬場大批量檢測(cè)需求，為PBoV的流行病學(xué)調(diào)查研究和臨床檢測(cè)提供了良好的檢測(cè)技