豬博卡病毒間接ELISA診斷方法的建立.pdf

1、豬博卡病毒(PBoV)最早于2009年在瑞典被發(fā)現(xiàn)，迄今為止，對于其傳播方式，侵染機制，及其基因組功能都不甚明了，但是世界各國學者在進行該病毒的流行病學調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，該病毒在PMWS患豬中陽性率較高。另外還有學者提出豬博卡病毒可能與呼吸道疾病病原共感染機體。目前大多認為其基因組編碼3個開放閱讀框(ORF)分別對應(yīng)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、抗原蛋白VP、和非結(jié)構(gòu)蛋白NP1，VP蛋白為豬博卡病毒主要的抗原蛋白，但變異性較高，非結(jié)構(gòu)蛋白NP1，編碼一個

2、相對保守且高度磷酸化的非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)。目前世界各國對該病毒的檢測也僅僅局限于一些不成熟的PCR檢測方法，并無血清學檢測方法的問世，因而有效的血清學診斷方法的研究迫在眉睫，本研究成功的在河北地區(qū)病豬體內(nèi)提取出豬博卡病毒基因，分別對NP1基因和VP2基因進行B細胞線性抗原表位的預測分析，并對保守的NP1基因和截短的相對保守的VP2基因進行克隆表達，分別將純化的NP1蛋白和VP2截短蛋白作為包被抗原，經(jīng)過優(yōu)化條件和相對比較建立了快速檢測豬博卡

3、病毒病的血清學診斷方法。
　　根據(jù)NCBI系統(tǒng)中GenBank已發(fā)表的豬博卡病毒NP1和VP2基因序列，設(shè)計合成特異性引物，采用降落PCR技術(shù)擴增NP1基因和截短的VP2基因序列，克隆后進行測序，測序正確后進行克隆載體與加酶切位點的目的片段的連接轉(zhuǎn)化，并分別將質(zhì)粒命名為PMD-NP1和PMD-VP2。對重組質(zhì)粒PMD-NP1和PMD-VP2進行雙酶切得到帶酶切位點的NP1基因和截短的VP2基因并將其與原核表達載體pET32a連接，

4、構(gòu)建表達質(zhì)粒pET32a-NP1和pET32a-VP2。經(jīng)IPTG誘導后SDS-PAGE電泳可分別檢測到分子質(zhì)量約為44ku和35 ku的蛋白，與預期的蛋白分子量大小基本一致，以可溶性形式存在于上清中，同時在包涵體中也大量存在。利用原核表達載體pET32a上帶有的His標簽對pET32a-NP1和pET32a-VP2重組蛋白進行純化，純化蛋白經(jīng)Western-blotting結(jié)果顯示，重組蛋白與PBOV陽性血清具有良好的反應(yīng)原性。表明分

5、子質(zhì)量約43 ku和37 ku的蛋白即為目的蛋白。
　　以純化的兩種重組蛋白分別作為包被抗原，通過對各自反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測PBoV抗體的間接ELISA檢測方法，并比較兩種ELISA檢測方法。優(yōu)化結(jié)果顯示，以NP1蛋白為包被抗原的抗原最佳包被濃度為4μg/mL;封閉液為2％的明膠工作液;陰陽性血清最佳稀釋度為1∶80，二抗的最佳稀釋度為1∶1000，底物顯色時間為10 min。該方法與CSFV、PRRSV、PPV、PCV2陽

6、性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，批內(nèi)和批間重復性試驗的變異系數(shù)(CV)均值都小于10％，而以VP2蛋白為包被抗原的抗原最佳包被濃度為2μg/mL;封閉液為2％的明膠工作液;陰陽性血清最佳稀釋度為1∶80，酶標抗體最佳稀釋度為1∶1000，底物顯色時間為15 min。該方法與CSFV、PRRSV、PPV、PCV2陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，批內(nèi)重復性試驗和批間重復性試驗的變異系數(shù)(CV)均小于10％，說明該方法具有較好的特異性和重復性，同時通過比較發(fā)現(xiàn)