發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒傳播機(jī)制及人源單克隆抗體研究.pdf

1、背景：
　　發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndromevirus，SFTSV)，屬布尼亞病毒科白蛉病毒屬，是一種分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組包括L、M和S三個(gè)片段。由SFTSV感染所致的疾病稱為發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、乏力、肌肉酸痛、

2、全身不適、惡心和嘔吐等，嚴(yán)重者出現(xiàn)多器官衰竭甚至死亡。SFTS流行于東亞，包括中國(guó)、日本和韓國(guó)。SFTS的病死率高達(dá)30％，平均約12％。
　　SFTSV經(jīng)蜱叮咬傳播，也可通過接觸病人血液和分泌物感染。蜱為吸血媒介，可被其吸食血液的動(dòng)物分布廣泛，但這些動(dòng)物，特別是小型哺乳動(dòng)物在SFTSV傳播過程中的作用尚不明確。SFTSV可能起源于中國(guó)中部淮陽山區(qū)域，但病毒在中國(guó)、日本和韓國(guó)的傳播路徑尚不清楚。目前針對(duì)該疾病，既無特效藥物，也無有

3、效的疫苗可供使用，對(duì)患者主要采取廣譜抗病毒治療和對(duì)癥支持治療。針對(duì)危重患者，中和抗體治療將是行之有效的方法。SFTS流行特征的解析、傳播模式的探討及抗體藥物的研發(fā)，對(duì)豐富SFTS的病原學(xué)知識(shí)、流行病學(xué)理論、疾病的預(yù)防控制和診斷治療具有重要意義。
　　目的：
　　通過監(jiān)測(cè)、分析自然狀態(tài)下小型宿主動(dòng)物SFTSV感染狀況，探討其在SFTSV傳播過程中所起作用，為該病的預(yù)防控制提供理論依據(jù);通過對(duì)SFTSV全基因組進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，

4、探討SFTSV起源及可能傳播路徑，為SFTS的流行趨勢(shì)預(yù)測(cè)提供重要線索;研究SFTSV人源單克隆抗體，為SFTS的特效治療提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.動(dòng)物標(biāo)本采集及檢測(cè)
　　(1)2013年1月至8月，以山東省青島市黃島區(qū)膠南地區(qū)為調(diào)查點(diǎn)，捕獲宿主動(dòng)物，并對(duì)宿主動(dòng)物進(jìn)行種屬鑒定，采集宿主動(dòng)物脾臟、肝臟和心臟血標(biāo)本。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

5、檢測(cè)心臟血SFTSV總抗體。自宿主動(dòng)物脾臟提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversedtranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)及巢式PCR擴(kuò)增SFTSV M和S片段部分基因序列，并進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果運(yùn)用NCBI-BLAST與數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，判斷其是否為SFTSV序列，并將所得到的SFTSV序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得GenBank號(hào)碼。根據(jù)ELISA和PCR擴(kuò)增結(jié)果，分

6、別計(jì)算宿主動(dòng)物SFTSV抗體陽性率和SFTSV帶毒率，并綜合抗體陽性率和宿主動(dòng)物帶毒率，計(jì)算宿主動(dòng)物感染率。
　　(2)將所得序列與自NCBI獲得的參考株序列建立數(shù)據(jù)集，以Mega5.0軟件Clustal W程序進(jìn)行比對(duì)，采用Neighbor-joining(NJ)法Kimura2-parameter distance模型，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹并進(jìn)行自展信度檢驗(yàn)。
　　2.SFTSV遺傳進(jìn)化分析
　　(1)從NCBI Gen

7、Bank數(shù)據(jù)庫搜索并下載SFTSV病毒株序列信息，明確每株病毒標(biāo)本采集時(shí)間、地點(diǎn)。對(duì)病毒株的L、M和S片段序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用最大似然法(Maximum Likelihood Method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
　　(2)利用基因重組預(yù)測(cè)軟件Recombination Detection Program version3.44(RDP3)對(duì)病毒全基因組進(jìn)行初步預(yù)測(cè)，確定可能的基因重配株。結(jié)合L、M和S片段序列系統(tǒng)發(fā)育分析中病毒株

8、的分布，確定基因重配株。
　　(3)基于貝葉斯馬爾可夫鏈蒙特卡洛(Bayesian Markov chain Monte Carlo，MCMC)原理及分予鐘模型，運(yùn)用軟件BEAST v1.8.0對(duì)病毒株的L、M、 S片段序列及全基因組序列進(jìn)行分析，確定病毒SFTSV的進(jìn)化速率、分化時(shí)間及最近共同祖先(the most recent common ancestor，TMRCA)出現(xiàn)的時(shí)間。為檢驗(yàn)病毒的進(jìn)化速率是否是隨機(jī)的，對(duì)序列信息

9、進(jìn)行隨機(jī)化，用真實(shí)時(shí)間數(shù)據(jù)得出的進(jìn)化速率和隨機(jī)化的進(jìn)化速率進(jìn)行比較，從而確定病毒的進(jìn)化速率是否是隨機(jī)的?；诓《局嘏浜头只瘯r(shí)間對(duì)病毒傳播路徑進(jìn)行分析推測(cè)。
　　3.SFTSV人源單克隆抗體制備及生物學(xué)功能研究
　　(1)利用蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)SFTSV糖蛋白跨膜序列，確定胞外區(qū)序列。構(gòu)建包含SFTSV糖蛋白Gn和Gc胞外區(qū)的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，并表達(dá)純化蛋白Gn、Gc。
　　(2)從病人外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞，采用

10、流式細(xì)胞術(shù)分選針對(duì)SFTSV糖蛋白的記憶B細(xì)胞。RT-PCR、PCR擴(kuò)增記憶B細(xì)胞中抗體可變區(qū)基因序列，重疊PCR法將抗體可變區(qū)與恒定區(qū)連接，構(gòu)成抗體輕、重鏈全序列。將抗體輕、重鏈全序列克隆入真核表達(dá)載體，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒。將包含抗體輕、重鏈全序列的重組真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK293T，利用WesternBlot初步篩選可以表達(dá)抗SFTSV Gn或Gc抗體的輕、重鏈質(zhì)粒組合。對(duì)初步篩選到的抗體，利用ELISA、間接免疫熒

11、光和空斑減少中和試驗(yàn)進(jìn)一步研究抗體的蛋白結(jié)合活性、病毒結(jié)合活性和中和活性。
　　結(jié)果：
　　1.捕獲動(dòng)物種屬構(gòu)成及感染狀況
　　(1)2013年1～8月，在山東省青島市黃島區(qū)膠南地區(qū)，共捕獲小型哺乳動(dòng)物774只，涵蓋2目3科5屬6種，包括褐家鼠（157只，20.3％）、小家鼠（183只，23.6％）、大倉(cāng)鼠（135只，17.4％）、黑線姬鼠（188只，24.3％）、黑線倉(cāng)鼠（18只，2.3％）及鼩鼱（93只，12.0％

12、）。戶內(nèi)捕獲嚙齒鼠類及鼩鼱376只，包括褐家鼠（151只，40.2％）、小家鼠（172只，45.7％）及鼩鼱(53只，14.1％)。野外捕獲嚙齒鼠類及鼩鼱398只，包括褐家鼠（6只，1.5％）、小家鼠（11只，2.8％）、大倉(cāng)鼠（135只，33.9％）、黑線姬鼠（188只，47.2％）、黑線倉(cāng)鼠（18只，4.5％）及鼩鼱（40只，10.1％）。
　　(2)捕獲的774只宿主動(dòng)物中，共獲得有效心臟血標(biāo)本755份，包括156份褐家鼠標(biāo)

13、本、182份小家鼠標(biāo)本、125份大倉(cāng)鼠標(biāo)本、186份黑線姬鼠標(biāo)本、17份黑線倉(cāng)鼠標(biāo)本及89份鼩鼱標(biāo)本。雙抗原夾心ELISA檢測(cè)，得到陽性標(biāo)本9份，包括小家鼠標(biāo)本2份、大倉(cāng)鼠標(biāo)本1份、黑線姬鼠標(biāo)本2份、鼩鼱標(biāo)本4份。宿主動(dòng)物SFTSV抗體陽性率為1.2％，嚙齒鼠類、鼩鼱的抗體陽性率分別為0.8％及4.5％。鼩鼱的抗體陽性率高于嚙齒鼠類（P=0.014）。捕獲的774只宿主動(dòng)物中，共獲得有效脾臟RNA標(biāo)本517份，包括116份褐家鼠標(biāo)本、1

14、03份小家鼠標(biāo)本、83份大倉(cāng)鼠標(biāo)本、129份黑線姬鼠標(biāo)本、9份黑線倉(cāng)鼠標(biāo)本及77份鼩鼱標(biāo)本。經(jīng)RT-PCR、巢式PCR檢測(cè)，得到陽性標(biāo)本5份，包括褐家鼠標(biāo)本1份、小家鼠標(biāo)本1份、大倉(cāng)鼠標(biāo)本1份、鼩鼱標(biāo)本2份。宿主動(dòng)物SFTSVRNA陽性率為1.0％，嚙齒鼠類、鼩鼱的RNA陽性率分別為0.7％及2.6％，鼩鼱的RNA陽性率略高于嚙齒鼠類，兩者之間差異并不明顯(P=0.162)。3月、6月的RNA陽性率分別為4.7％(4/86)、1.7％(

15、1/62)，其他月份未檢測(cè)到SFTSVRNA，可以認(rèn)為3、6月的RNA陽性率高于其他月份(P=0.043)。2013年1～8月間，共檢測(cè)宿主動(dòng)物標(biāo)本755份，其中陽性標(biāo)本14份，宿主動(dòng)物的感染率為1.9％(14/755)，嚙齒鼠類的感染率為1.2％(8/666)，鼩鼱的感染率為6.7％(6/89)，鼩鼱的感染率高于嚙齒鼠類(P=0.003)，說明鼩鼱在SFTSV的傳播中可能起更重要作用。戶內(nèi)宿主動(dòng)物感染率為2.4％(9/372)、野外宿

16、主動(dòng)物感染率為1.3％(5/383)，戶內(nèi)宿主動(dòng)物感染率稍高于野外，差異不明顯(P=0.291)。戶內(nèi)嚙齒鼠類感染率為1.2％(4/321)，戶內(nèi)鼩鼱感染率為9.8％(5/51)，高于嚙齒鼠類（P=0.003）;野外嚙齒鼠類感染率為1.2％(4/345)，野外鼩鼱感染率為2.6％(1/38)，稍高于野外嚙齒鼠類，差異不明顯（P=0.474）。嚙齒鼠類戶內(nèi)、野外感染率基本無差別，而鼩鼱?wèi)魞?nèi)感染率明顯高于野外（P=0.001），說明戶內(nèi)鼩鼱

17、在SFTSV傳播過程中起重要作用。
　　2.遺傳進(jìn)化分析
　　(1)從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中，我們得到符合條件的SFTSV病毒株122株，這些病毒株的時(shí)間跨度為2010年至2014年。122株病毒中，108株來自中國(guó)、8株來自日本、6株來自韓國(guó)。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，122株病毒被分成5個(gè)主要分支，分別標(biāo)記為A、B、C、D和E。
　　(2)軟件RDP4分析顯示，共14株病毒可能為基因重配株，結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化分析判斷，

18、6株病毒為基因重配株。LN2012-14、LN2012-34、LN2012-41和LN2012-42的基因組成形式為DAD，LN2012-58為DAA，AHL為EBD。
　　(3)L片段、M片段、S片段、全基因組平均進(jìn)化速率各不相同。L片段的進(jìn)化速率為4.16 E-4 s/s/y(substitutions per site peryear)(95％ HPD=8.99 E-5-9.72 E-4 s/s/y），M片段的進(jìn)化速率為6.

19、76 E-4 s/s/y(95％ HPD=3.92E-4-1.00 E-3 s/s/y)，S片段的進(jìn)化速率為1.09E-3 s/s/y(95％ HPD=5.43E-4-1.60 E-3 s/s/y)，全基因組平均進(jìn)化速率為6.73 E-4 s/s/y(95％ HPD=2.35E-4-1.09 E-3 s/s/y)。SFTSV起源于中國(guó)中部淮陽山區(qū)域，大約42年前病毒開始沿不同方向分化;約37年前，病毒從河南傳播到山東;約33年前，病毒從

20、江蘇傳播到遼寧;約31年前，病毒傳播到浙江舟山群島、日本及韓國(guó)南部濟(jì)州島。
　　3.人源單克隆抗體制備及其生物學(xué)活性研究
　　(1)成功構(gòu)建表達(dá)SFTSV Gn和Gc胞外段蛋白的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-SP-Gn-StrepⅡ和pCAGGS-SP-Gc-StrepⅡ，通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，并純化Gn和Gc蛋白。細(xì)胞上清中，Gn以二聚體、多聚體的形式存在，Gc大部分以單體的形式存在，小部分以二聚體的形式存在。
　　

21、(2)利用Western Blot初步篩選出可以表達(dá)抗體的輕、重鏈質(zhì)粒組合7組，表達(dá)的抗體分別標(biāo)記為Ab03、Ab05、Ab52、Ab62、Ab63、Ab64和Ab71。除抗體Ab03外其他6株抗體都可以與SFTSV糖蛋白Gn結(jié)合;抗體Ab05、Ab63和Ab71能與病毒結(jié)合，而抗體Ab03、Ab52、Ab62和Ab64不能與病毒結(jié)合;無抗體有中和活性。
　　結(jié)論：
　　1.自然狀態(tài)下，鼠類及食蟲目動(dòng)物鼩鼱小型哺乳動(dòng)物可感染

22、并攜帶SFTSV，可能是SFTSV的儲(chǔ)存宿主，可能在病毒的傳播中起重要作用。與鼠類相比，鼩鼱可能在SFTSV的擴(kuò)散過程中發(fā)揮更重要作用。
　　2.SFTSV進(jìn)化速率相對(duì)較低，基因突變?cè)谶M(jìn)化過程中起到純化作用;基因重配發(fā)生率較高，可能是SFTSV進(jìn)化的主要?jiǎng)恿?。SFTSV可能源于中國(guó)中部淮陽山區(qū)域，然后傳播至中國(guó)東部、東北部地區(qū)及日本、韓國(guó)。
　　3.在pH為8.0的條件下，SFTSV糖蛋白Gn以聚體的形式存在，而糖蛋白Gc大