“發(fā)熱伴血小板減少綜合征”病毒傳播媒介及宿主調(diào)查研究.pdf

1、2010年5月經(jīng)中國疾病預防與控制中心病毒病所專家證實，在一類以“發(fā)熱伴血小板減少綜合征”為主要臨床表現(xiàn)的患者血清中發(fā)現(xiàn)了一種新型布尼亞病毒，并命名為發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV)。該病毒屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)，白蛉病毒屬(Phlebovirus)，病毒顆粒呈球形，直徑80-100nm，外有

2、脂質(zhì)包膜，表面有棘突?；蚪M包含三個單股負鏈RNA片段（L、M和S），L片段全長為6368nt，包含單一讀碼框架編碼RNA依賴的RNA聚合酶;M片段全長為3378nt，包含單一讀碼框架編碼1073個氨基酸的糖蛋白前體;S片段全長為1744nt，為一雙義RNA，基因組以雙向的方式分別編碼病毒核蛋白NP和非結(jié)構(gòu)蛋白NSs。病毒基因組兩端的11個堿基序列呈高度保守，與白蛉病毒屬其他病毒成員相同，可形成鍋柄狀的二級結(jié)構(gòu)[1]。已知的其他的布尼亞

3、病毒科病毒抵抗力弱，不耐酸、易被熱、乙醚、去氧膽酸鈉和常用消毒劑及紫外線照射等迅速滅活[2]。
　　 目前已在河南、湖北、山東、安徽、遼寧、江蘇等省發(fā)現(xiàn)該病病例，主要分布在以上省份的山區(qū)和丘陵地帶的農(nóng)村，呈高度散發(fā)。本病多發(fā)于春、夏季，不同地區(qū)可能略有差異。人群普遍易感，在丘陵、山地、森林等地區(qū)生活、生產(chǎn)的居民和勞動者以及赴該類地區(qū)戶外活動的旅游者感染風險較高，傳播途徑尚不明確，部分病例有明確的蜱叮咬史。此外，有文獻報道，接觸危

4、重病人急性期血液具有人傳人的可能性，應引起患者家屬和衛(wèi)生工作者的重視，做好個人防護[2]。布尼亞病毒在自然界的傳播-循環(huán)的模式主要有兩種:1、以Lacrosse病毒為例，其在自然界中主要傳播媒介為蚊蟲，主要擴增宿主為小型嚙齒動物（松鼠、花栗鼠等），雌蚊可通過卵將病毒傳播給下一代，這也是Lacrosse病毒過冬的主要機制;此外，通過交配的方式雄蚊可將病毒傳播給雌蚊，引起在蚊種群中的擴散;感染的蚊蟲通過叮咬小型嚙齒動物，在動物體內(nèi)引起病毒血

5、癥，其他蚊蟲叮咬被感染的動物引起該病毒進一步擴散，感染的蚊蟲叮咬人，可在人群中引起疾病。2、以漢坦病毒為例，該類病毒主要通過嚙齒動物進行傳播，主要有水平傳播（撕咬、糞、尿和氣溶膠），垂直傳播（感染的雌鼠將病毒傳播給子代），人接觸感染性的糞、尿、氣溶膠或被咬傷也可導致感染[3]。除流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)部分病例有蜱叮咬史之外，SFTS病毒在自然界的傳播-循環(huán)模式尚不清楚。
　　 本研究中，采集疫區(qū)的媒介標本，以及動物血清，對標本中病毒R

6、NA的含量、動物血清中的特異性抗體進行檢測，從陽性標本中分離病毒，并進行全基因組序列測定。通過同源性比較、系統(tǒng)發(fā)育分析、病毒體外復制特性比較、抗原性比較等不同方面闡釋蜱、羊和狗，作為該新型病毒媒介和宿主的可能性。此外，開展理化特性實驗和藥敏實驗，以期對該新型病毒生物學特性有較全面的研究，為進一步開展相關(guān)工作提供基礎(chǔ)資料。
　　 [研究目的]：
　　 1.探索“發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒”在傳播媒介及宿主中的流行情況;

7、r>　　 2.分析比較該病毒的病原學和分子生物學特征;
　　 3.了解該病毒的生物學特性，為開展相關(guān)研究奠定理論基礎(chǔ)。
　　 [研究方法]：
　　 1.采集疫區(qū)的蜱和家畜血清標本，通過實時熒光定量PCR和雙抗體夾心法ELISA及間接免疫熒光法(IFA)，檢測媒介和動物血清中發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒RNA和動物血清中特異抗體;
　　 2.病毒RNA檢測陽性的標本，采用細胞培養(yǎng)技術(shù)分離病毒，并通過間接免疫

8、熒光實驗進行鑒定;
　　 3.通過RT-PCR方法，對熒光定量PCR檢測陽性標本和分離毒株進行序列測定，并進行同源性比較和系統(tǒng)發(fā)育分析;
　　 4.通過生長動態(tài)實驗，觀察該病毒的復制特性，通過交叉中和實驗和間接免疫熒光實驗，比較不同標本中分離得到的病毒株的抗原特性差異;
　　 5.通過滅活實驗，探索該病毒的滅活條件;
　　 6.開展理化特性研究，觀察該病毒對不同理化因素的敏感性;
　　 7.通過藥

9、敏實驗，觀察利巴韋林對該病毒的體外抑制效果。
　　 [結(jié)果]：
　　 1.標本采集和SFTS病毒核酸檢測:共采集山東蓬萊、萊州2市22戶病人及鄰居家畜寄生蜱140頭，主要采自牛、羊、狗三種動物，動物帶蜱率100％（帶蜱率=帶蜱數(shù)/檢查動物數(shù)）。經(jīng)分類鑒定，所采蜱主要從屬于3屬3種，分別為血蜱屬（長角血蜱、扇頭蜱屬血紅扇頭蜱以及草皮屬森林革蜱，其中長角血蜱為優(yōu)勢蜱種，構(gòu)成比為91.4％，森林革蜱和血紅扇頭蜱分別占5％、3.

10、6％。對蜱研磨液進行多重熒光定量PCR結(jié)果顯示，SFTS病毒核酸陽性3頭，均為長角血蜱，其中2頭采自病人家庭飼養(yǎng)的狗體表，1頭采自羊體表。蜱最小感染率為2.14％(最小感染率=陽性組數(shù)/蛑總數(shù)×100％)，蚊標本研磨液未檢測到病毒RNA。共采集動物血液標本106份，其中牛血清21份、羊血清50份、狗血清35份，其病毒RNA陽性率分別為4.7％、6％、2.8％。
　　 2.SFTS病毒抗體檢測:共采集動物血液標本106份，其中牛血

11、清21份、羊血清50份、狗血清35份，ELISA檢測的總抗體陽性率分別為0％、60％、19％，間接免疫熒光檢測的抗體陽性率分別為0％、60％、19％。
　　 3.病毒分離及鑒定:SFTS病毒核酸檢測陽性的標本，經(jīng)連續(xù)三代細胞分離培養(yǎng)，通過SFTS病毒核酸檢測和間接免疫熒光檢測法鑒定，從采自山東萊州的蜱研磨液、狗血清以及羊血清中各分離到一株病毒。
　　 4.序列測定及比對分析:將從蜱研磨液、狗血清以及羊血清中分離的毒株，進

12、行全序列測定，從蜱中分離的毒株的序列與病人血清中分離的毒株核酸序列S、M、L片段的同源性分別為94.9％-99.3％，95.2％-99.6％，95.9％-98.9％;從羊血清標本中分離的毒株與病人血清中分離的毒株核酸序列S、M、L片段的同源性分別為95.2％-100％，95.6％-98.1％，96％-98.1％;從狗血清標本中分離的毒株與病人病人血清中分離的毒株核酸S、M、L片段的同源性分別為94.8％-98.2％，95.9％-97.5

13、％，95.9％-98.1％;通過系統(tǒng)發(fā)育分析，未發(fā)現(xiàn)各毒株之間有明顯的聯(lián)系，不同省份分離到的毒株聚為一類，沒有明顯的地域特征。
　　 5.病毒生長動態(tài):通過觀察該病毒的復制特性，未發(fā)現(xiàn)蜱源病毒株和人源病毒株的生長趨勢有明顯差別，第1-3天，病毒復制緩慢，第5-7天病毒進入對數(shù)生長期，第7-10天病毒達到生長平臺期，病毒滴度可達3*107(TCID50/ml)。
　　 6.病毒抗原性比較:通過間接免疫熒光法和交叉中和試驗檢

14、測，未發(fā)現(xiàn)從人、羊、狗、蜱不同標本分離的毒株與相同恢復期血清反應的抗體滴度有明顯差異，均在4倍以內(nèi)。這提示不同標本中分離的毒株在抗原性無明顯差異。
　　 7.SFTS病毒生物學特性:通過理化特性分析，該病毒在60℃水浴30min、福爾馬林(1∶2000)、β-丙內(nèi)酯(1∶4000)條件下即可完全滅活，對熱、乙醚、氯仿、紫外RNAH3、丙酮等理化因素敏感，并通過藥敏實驗發(fā)現(xiàn)利巴韋林能體外有效抑制病毒的復制。
　　 [結(jié)論]

15、：
　　 1.通過病毒RNA檢測，發(fā)現(xiàn)該病毒核酸在蜱和動物血清中都有檢出，并且病毒抗體在動物中有較高的陽性率，提示該病毒在當?shù)丨h(huán)境中廣泛存在。
　　 2.首次在長角血蜱、羊血清和狗血清中分離到病毒，從病原學上證實蜱和羊、狗做為該新型病毒傳播媒介和宿主的可能性;在牛、羊、狗血清中均檢測到該病毒的特異性抗體，從血清學上證實其作為宿主的可能性。
　　 3.將從長角血蜱、羊血清、狗血清和人血清中分離到毒株進行全序列測定，