嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒糖蛋白Gn的免疫原性研究.pdf

1、目的:
　　研究SFTSV糖蛋白Gn的體液和細(xì)胞免疫原性。
　　方法:
　　1.參考SFTSV HB29病毒株的糖蛋白Gn編碼基因(GenBank:HM745931.1)，優(yōu)化編碼Gn的密碼子，氨基酸序列保持不變。化學(xué)合成得到的野生型序列WSP-Gn經(jīng)PCR反應(yīng)分別在WSP-Gn的5'端和3'端引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，在Gn的5'端和3'端引入NheⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，然后將上述序列分別克隆到真核表達(dá)載

2、體pJW4303，構(gòu)建重組質(zhì)粒pJW4303-WSP-Gn和pJW4303-tPA-Gn?；瘜W(xué)合成得到的密碼子優(yōu)化型序列WSP-Gn-opt經(jīng)PCR反應(yīng)分別在Gn-opt的5'端和3'端引入NheⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，克隆到pJW4303載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pJW4303-tPA-Gn-opt。
　　2.以上述重組質(zhì)粒和空載體pJW4303分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清和裂解液，Western blot檢測(cè)糖蛋白Gn

3、的表達(dá)。
　　3.將上述重組質(zhì)粒及空載體pJW4303以肌肉注射、活體基因?qū)敕绞矫庖連ALB/c小鼠，免疫時(shí)間點(diǎn)為第0、2、4、8周，分別在每次免疫前和第6、10周進(jìn)行內(nèi)眥采血收集血清。通過ELISA法檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠血清中特異性IgG、IgG1、IgG2a水平。
　　4.通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)Gn的CTL表位肽，優(yōu)選其中的16條(P1～P16)用Elispot方法篩選并進(jìn)行后續(xù)研究。按上述方法分別于第0、2、4周免疫B

4、ALB/c小鼠，在第7、17、31、60、90天分批處死小鼠取脾細(xì)胞，用Elispot技術(shù)檢測(cè)分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞。
　　結(jié)果:
　　1.酶切鑒定和基因測(cè)序正確，即成功構(gòu)建SFTSV糖蛋白Gn表達(dá)質(zhì)粒pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn和pJW4303-tPA-Gn-opt。
　　2.糖蛋白Gn在293T細(xì)胞的表達(dá):pJW4303-WSP-Gn和pJW4303-tPA-Gn編碼Gn可在HEK2

5、93T細(xì)胞內(nèi)表達(dá);pJW4303-tPA-Gn-opt編碼Gn在HEK293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并分泌到細(xì)胞外。
　　3.體液免疫應(yīng)答:pJW4303-WSP-Gn、pJW4303-tPA-Gn、pJW4303-tPA-Gn-opt均能誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生抗Gn特異性IgG、IgG1、IgG2a抗體;pJW4303-tPA-Gn-opt誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體較pJW4303-WSP-Gn和pJW4303-tPA-Gn免疫組出現(xiàn)時(shí)間更早、

6、滴度更高，且IgG2a/IgG1接近1，其誘導(dǎo)的Th免疫應(yīng)答更趨于平衡。
　　4.CTL免疫應(yīng)答:肽P1、P10能夠刺激重組質(zhì)粒免疫小鼠淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ，且P10相對(duì)于P1誘導(dǎo)的CTL免疫應(yīng)答更強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間更久;P1刺激組，pJW4303-WSP-Gn誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答較其它兩組為優(yōu)，P10刺激組，pJW4303-tPA-Gn-opt誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答較其它兩組為優(yōu)。
　　結(jié)論:
　　1.SFTSV糖蛋白Gn具有良好