豬繁殖與呼吸綜合征病毒單克隆抗體的制備及應(yīng)用.pdf

1、應(yīng)用Mare-145細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)技術(shù)從福建省某豬場(chǎng)患繁殖障礙的豬血清中分離到一株病毒，經(jīng)分析、鑒定證實(shí)該病毒為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)并將其命名為PRRSV-FJ0601株。采用差速和蔗糖不連續(xù)密度梯度離心純化的PRRSV福州株(PRRSV-FZ)病毒抗原免疫Balb/c小鼠，取其脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行融合，以間接EIASA篩選并經(jīng)三次有限稀釋法克隆，獲得三株能穩(wěn)定分泌抗PRRSV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株

2、，分別命名為：McAb-A61、McAb-B47和McAb-C65。測(cè)定了單抗的生物學(xué)特性，制備了McAb-A61異硫氫酸熒光素標(biāo)記物并用于檢測(cè)PRRSV。獲得如下結(jié)果： 1、PRRSV-FJ0601株的分離與鑒定：從患繁殖障礙的發(fā)病豬血清中分離到一株病毒。該病毒能在Mare-145細(xì)胞上增殖并產(chǎn)生細(xì)胞病變(CPE)，不能在PK-15、Vero上增殖；病毒對(duì)Marc-145細(xì)胞的致病變作用能被PRRSV陽性血清中和；間接免疫熒光

3、試驗(yàn)證實(shí)分離毒能被PRRSV-FZ株單克隆抗體特異性識(shí)別：以分離毒核酸為模板，PRRSV保守序列為引物的RT-PCR能擴(kuò)增出長(zhǎng)443bp的特異性DNA片段。上述分析結(jié)果表明該分離毒為PRRSV。 2、單抗的生物學(xué)特性：經(jīng)分析、鑒定，McAb-A61、McAb-B47和McAb-C65抗體的亞級(jí)份分別為IgG<,1>、IgG<,3>和IgG<,1>亞類；細(xì)胞培養(yǎng)上清液和小鼠腹水抗體的ELISA效價(jià)分別為2<'6>~2<'8>和10

4、<'5>～10<'6>；特異性分析結(jié)果表明三株單抗均能與PRRSV的FZ株、V2332株和FJ-1株等毒株反應(yīng)，而不與Marc-145細(xì)胞、豬圓環(huán)病毒2型病毒和豬細(xì)小病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。Western-blot試驗(yàn)顯示：三株單抗都與病毒蛋白中約26 KD蛋白條帶呈陽性反應(yīng)，表明三株都是針對(duì)PRRSV GP5蛋白的單抗。間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)結(jié)果表明：MeAb-A61和MeAb-B47單抗能與PRRSV FZ株和V2332株反應(yīng)，但不與

5、FJ-1株反應(yīng)；而McAb-C65則與三株供試的FZ株、V2332株和FJ-1株都能反應(yīng)。IFA結(jié)果提示PRRSV的抗原表位可能存在空間分布上的差異，在有機(jī)溶劑作用下PRRSV-FJ-1株與McAb-A61和McAb-B47相對(duì)應(yīng)的抗原位點(diǎn)產(chǎn)生構(gòu)像變化，使其散失與單抗結(jié)合的能力。 3、McAb-A61的熒光素標(biāo)記與直接熒光方法的建立：采用飽和硫酸銨法純化McAb-A61腹水抗體并與異硫氫酸熒光素(FITC)進(jìn)行標(biāo)記，制備出McA