5種出血熱病毒RPA檢測方法的建立及其假病毒陽性參考品的制備.pdf

1、病毒性出血熱(Viral hemorrhagic fevers, VHFs)是一類由RNA病毒引起，并以發(fā)熱和出血為主要臨床表現(xiàn)特征的可危及人類和動物生命健康的急性傳染病[1]，該病主要由絲狀病毒科、黃病毒科、沙粒病毒科和布尼亞病毒科等4種不同科的病毒引起。出血熱病死率高，危害嚴重，并且大部分無可用疫苗和有效的治療手段，因此，建立出血熱病毒快速、簡便，尤其是適用于現(xiàn)場的應急檢測方法，對于及時篩查可疑患者及早控制病毒的傳播流行具有重要意義

2、。
　　扎伊爾型埃博拉病毒(Zaire ebolavirus, ZEBOV)、蘇丹型埃博拉病毒(Sudan ebolavirus, SEBOV)、拉沙病毒(Lassa virus, LASV)、馬爾堡病毒(Marburg virus, MARV)和黃熱病毒(Yellow fever virus, YFV)等均屬于出血熱相關(guān)病毒，具有很高的傳染性和致死率，并且都曾在國外引起不同程度的暴發(fā)流行，造成了極大的危害。目前在我國未曾發(fā)現(xiàn)這些

3、病毒的傳播和流行，但是隨著我國對外交流日益頻繁，這些病毒的輸入性風險不斷增大[2]，為防范于未然，我們有必要對這些病毒進行更加深入的研究，并建立該類病毒快速簡便的檢測技術(shù)，以便及早地發(fā)現(xiàn)和鑒別病原體，為有效阻斷病毒的傳播奠定基礎(chǔ)。
　　目前對于出血熱病毒的實驗室檢測方法主要包括病毒分離鑒定、核酸檢測[3]、抗原抗體檢測等。其中，病毒分離鑒定是疾病診斷的金標準，但通常需要較高的實驗室條件和操作技能，而且耗時較長，存在著生物安全風險[

4、4]。核酸檢測技術(shù)主要通過對病毒靶基因的特異性擴增來進行鑒別診斷，主要包括普通PCR和實時熒光定量PCR技術(shù)。普通PCR技術(shù)簡單易行，耗時短，但敏感性不高。實時熒光定量PCR技術(shù)具有快速、靈敏和特異性高的特點[5-8]，可以實時觀察整個擴增過程，并對初始擴增模板進行定量分析。以PCR為基礎(chǔ)的核酸檢測方法雖然簡單快速，但都需要較為昂貴的儀器設(shè)備并在實驗室中完成檢測。抗原抗體檢測目前應用較多的主要是ELISA檢測技術(shù)，雖然該檢測方法已經(jīng)發(fā)展

5、較為成熟，但與核酸檢測技術(shù)相比，過程仍舊較為繁瑣耗時。由此可見，以上病毒實驗室檢測方法在突發(fā)傳染病的現(xiàn)場快速檢測中存在局限。
　　本研究針對上述5種出血熱病毒建立一種基于新型核酸等溫擴增技術(shù)-重組酶聚合酶擴增(Recombinase polymerase amplification, RPA)[9,10]的檢測方法。該技術(shù)通過模擬體內(nèi)DNA復制的酶反應過程，可以在恒溫37℃-42℃之間對模板DNA進行指數(shù)式擴增，無需變性，在20分

6、鐘之內(nèi)即可完成整個擴增過程。RPA技術(shù)操作簡單，對設(shè)備要求低，具有靈敏度高、特異性強等特點。本研究根據(jù)上述5種病毒的基因保守區(qū)域設(shè)計并合成多套相應的RPA引物和探針，進行篩選優(yōu)化，得到具有靈敏度高、特異性強的RPA引物探針。其次，根據(jù)基因保守片段制備含5種出血熱病毒目的基因的假病毒作為RPA反應體系的陽性參考品。最后，對RPA反應體系進行優(yōu)化，并和Real-time PCR檢測方法進行靈敏度的比較，對RPA反應體系擴增性能進行了評價。<

7、br>　　將制備的假病毒作為模擬樣本處理，然后提取核酸進行RPA擴增，同時取本室保存的黃熱病毒減毒株17D（YF17D）提取病毒核酸，進行RPA擴增，以驗證建立的 RPA擴增技術(shù)的檢測效果。擴增結(jié)果表明，本次建立的 RPA檢測技術(shù)在37℃-42℃之間對這5種出血熱病毒的 RNA可以進行有效的擴增，具有良好的特異性。而擴增的靈敏度，黃熱病毒和馬爾堡病毒RPA擴增與實時熒光 PCR相同，達到1.5×102 copies/反應，扎伊爾型埃博拉