犬瘟熱病毒核蛋白基因的克隆、表達(dá)及其間接ELISA方法的建立.pdf

1、犬瘟熱病毒核蛋白基因的克隆、表達(dá)及其間接ELISA方法的建立摘要犬瘟熱是由犬瘟熱病毒(CanineDistemperVirus，CDV)感染所引起的一種急性、高度接觸性傳染病。本研究利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出CDVLP株N基因，進(jìn)行克隆，成功實(shí)現(xiàn)了N基因在大腸桿菌中的表達(dá)。對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行初步純化，利用純化的N基因重組蛋白初步建立了檢測(cè)CDV抗體的間接ELISA方法。1.根據(jù)GenBank中報(bào)道的CDVOnderstepoort株基因序列

2、，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，用該引物對(duì)分離的LP野毒株的N基因進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增，得到1572bp的PCR片段，純化后與克隆載體相連，構(gòu)建pGEM-N，用于核苷酸序列測(cè)定并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。2.根據(jù)GenBank中報(bào)道的CDVOnderstepoort株基因序列，又設(shè)計(jì)了一對(duì)N基因特異性引物，將擴(kuò)增得到的559bp的PCR片段純化后與克隆載體相連，構(gòu)建pMD18-N，用于核苷酸序列測(cè)定。將pMD18-N雙酶切，回收目的片段克隆到大腸桿菌

3、表達(dá)載體pET-28a(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28N，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。重組菌菌體裂解物經(jīng)SDS-PAGE電泳，可檢測(cè)到相對(duì)分子量約25KD的重組蛋白。免疫印跡證實(shí)該重組蛋白可與CDV多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。3.利用表達(dá)的核蛋白的重組融合蛋白作為抗原，建立了檢測(cè)CDV抗體的間接ELISA方法。結(jié)果表明：抗原的最適包被濃度為1ug/ml，最適包被條件為37℃1小時(shí)4℃過(guò)夜，待檢血清稀釋度為1∶400