土撥鼠肝炎病毒檢測(cè)方法的建立.pdf

1、目的：建立土撥鼠肝炎病毒(Woodchuckhepatitisvirus，WHV)核酸的熒光定量PCR(Real-timePCR)檢測(cè)方法及土撥鼠肝炎病毒表面抗原(WHsAg)的改良雙抗加心ELISA檢測(cè)方法，應(yīng)用于土撥鼠肝炎病毒模型的創(chuàng)制研究。
　　 方法：核酸檢測(cè)：分別根據(jù)土撥鼠肝炎病毒核心抗原(WHcAg)和表面抗原(WHsAg)的DNA序列設(shè)計(jì)13對(duì)擴(kuò)增引物，分別以混合土撥鼠肝臟DNA的WHV核酸DNA為模板進(jìn)行PCR，

2、從中篩選無非特異性擴(kuò)增及引物二聚體，且擴(kuò)增靈敏度高的引物，用于建立土撥鼠血清中WHVDNA的Real-timePCR檢測(cè)方法，并利用該方法對(duì)土撥鼠血清進(jìn)行了篩查。表面抗原檢測(cè)：原核表達(dá)WHsAg的N端區(qū)域，His·Tag鑷柱親和層析純化目的蛋白；用該蛋白分別免疫兔和蛋雞制備多克隆抗體并純化。建立用于檢測(cè)感染土撥鼠肝炎病毒的土撥鼠血清中WHsAg的雙抗夾心ELISA方法。
　　 結(jié)果：核酸檢測(cè)：根據(jù)WHsAg基因的5’端設(shè)計(jì)的一對(duì)

3、引物WHVSF1與WHVSR1，檢測(cè)靈敏度可達(dá)1×101拷貝/μL，病毒拷貝數(shù)與Real-timePCRCt值的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值為0.997，且電泳未見明顯非特異性條帶及引物二聚體。表面抗原檢測(cè)：純化后的WHsAg蛋白純度達(dá)到95％，免疫兔和蛋雞后分別制備相應(yīng)的抗WHsAg血清，純化得到相應(yīng)抗體，ELISA結(jié)果顯示兔抗WHsAg抗體的效價(jià)達(dá)1∶1，024，000，雞抗WHsAg抗體的效價(jià)為1∶64，000。本實(shí)驗(yàn)建立的雙抗加心ELISA