10種致腦炎病毒的基因芯片檢測(cè)方法建立.pdf

1、蟲媒病毒(Arbovirus)是指能在易感的節(jié)肢動(dòng)物如蚊、蜱等體內(nèi)進(jìn)行繁殖但不致病,而是通過(guò)叮咬的方式將病毒傳播給人畜等哺乳動(dòng)物,從而引起人畜嚴(yán)重疾病的一類病毒。蟲媒病毒包括黃病毒科、披膜病毒科、布尼亞病毒科等14個(gè)病毒科的540余種病毒,其中,我國(guó)已分離到9種,證實(shí)在我國(guó)流行的病毒有4種,分別為流行性乙型腦炎病毒、森林腦炎病毒、新疆出血熱病毒、登革病毒,其中,乙型腦炎病毒和森林腦炎病毒被國(guó)家列為法定報(bào)告?zhèn)魅驹础＝陙?lái),隨著國(guó)際化進(jìn)程加

2、快,境外蟲媒病毒傳入我國(guó)的可能性顯著增加,因此,快速準(zhǔn)確的檢測(cè)蟲媒病毒在傳染病防控上有重要意義。
　　 基因芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的一種多學(xué)科交叉的新技術(shù),具有高通量、高度平行性、自動(dòng)化等特點(diǎn)。本研究是以流行性乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、森林腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV)、登革病毒(Dengue virus,DE

3、NV)、狂犬病毒(Rabies virus,RV)、西尼羅病毒(West nile virus,WNV)、東方馬腦炎病毒(Eastern equineencephalitis virus,EEEV)、西方馬腦炎病毒(Western equine encephalitis virus,WEEV)、基肯孔雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)、裂谷熱病毒(Rift valley ferver virus,RVFV)、尼帕病

4、毒(Nipahvirus,NiV)10種可致人畜腦炎的人獸共患病為研究對(duì)象,其中,除RV外,均屬于蟲媒病毒范疇。本研究旨在制備一種可同時(shí)檢測(cè)JEV、TBEV、DENV、WNV、RV、CHIKV、WEEV、EEEV、RVFV、NiV的寡核苷酸基因芯片,用于對(duì)以上10種腦炎病毒進(jìn)行快速、早期檢測(cè)。本課題的研究將用于檢測(cè)10種致腦炎的人獸共患病病毒,對(duì)防止外來(lái)病原入侵,減少病毒對(duì)人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展的危害,有著重要的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

5、>　　 本課題首先根據(jù)GenBank上登錄的JEV、TBEV、DENV、WNV、RV、CHIKV、WEEV、EEEV全基因組序列和所構(gòu)建的質(zhì)粒RVFV、NiV的序列,通過(guò)DNA Star和DNAman等生物分析軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析,選擇了高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)寡核苷酸探針,每種病毒設(shè)計(jì)1-2條探針,共設(shè)計(jì)了18條寡核苷酸檢測(cè)探針,探針長(zhǎng)度約56mer；探針的Tm值為85±3℃;探針與其它病毒基因組的同源性不得大于50％。同時(shí)應(yīng)用Oligo

6、6.0和Primer premier5.0引物設(shè)計(jì)軟件,在該保守區(qū)域內(nèi),針對(duì)上述10種病毒共設(shè)計(jì)了15對(duì)特異引物,用于病毒靶核酸的多重PCR擴(kuò)增。將合成好的探針用50％的DMSO(二甲基亞礬)溶解到終濃度為30μM,經(jīng)變性處理后,點(diǎn)制到醛基化修飾的玻片上,以制備檢測(cè)芯片。
　　 提取待檢病毒RNA進(jìn)行隨機(jī)反轉(zhuǎn)錄,用15對(duì)特異引物經(jīng)優(yōu)化組合后共設(shè)立四個(gè)多重PCR擴(kuò)增體系:A組合(P3、P9、P10、P12各加1μl)； B組合(P

7、2加2μl,P11、P13各加1μl)； C組合(P4、P15各加2μl,P6、P8各加1μl)； D組合(P1加2μl；P5、P7、P14各加1μl)。各PCR反應(yīng)體系均為50μl,aa—dNTPs濃度為20μM,退火溫度為52℃,退火時(shí)間30s,延伸時(shí)間60s。多重PCR反應(yīng)體系標(biāo)記aa-dUTP后通過(guò)耦聯(lián)CyTM5熒光染料分子用于芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)。
　　 通過(guò)對(duì)雜交條件進(jìn)行優(yōu)化,最終確定點(diǎn)樣探針濃度為30μM,最佳雜交液濃

8、度含有40％甲酰胺,最佳雜交溫度為45℃,最佳雜交時(shí)間為2h。利用優(yōu)化后的雜交條件,對(duì)基因芯片進(jìn)行有效性、重復(fù)性、特異性、敏感性驗(yàn)證。用上述10種病毒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合后進(jìn)行芯片雜交,結(jié)果表明,在所有病毒探針位點(diǎn)均可以看到明顯的檢測(cè)信號(hào),而陰性對(duì)照信號(hào)較弱或沒有信號(hào),說(shuō)明該檢測(cè)方法有效性良好。從三批不同時(shí)間制備的芯片中各隨機(jī)抽取2張,用于驗(yàn)證芯片的穩(wěn)定性與重復(fù)性,雜交結(jié)果顯示,無(wú)論是同一批次之間的芯片還是不同批次之間的芯片,雜交效果理

9、想,穩(wěn)定性與重復(fù)性較好。用黃熱病毒(YFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、腸道病毒(EV71)、流感病毒(H1N1)進(jìn)行非特異性驗(yàn)證,結(jié)果表明,沒有非特異信號(hào)產(chǎn)生,說(shuō)明該檢測(cè)方法特異性良好。通過(guò)對(duì)TBEV、JEV、RV最低檢測(cè)病毒量和最低檢測(cè)拷貝數(shù)進(jìn)行該方法的敏感性試驗(yàn),結(jié)果表明,對(duì)TBEV最低檢測(cè)病毒量為87 TCID50,對(duì)JEV、RV最低檢測(cè)拷貝數(shù)分別為9.05×102、1.13×103。
　　 為進(jìn)一步驗(yàn)證本研究所建立的基因