犬瘟熱病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及H基因的測(cè)序分析.pdf

1、犬瘟熱(Canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的一種急性、高度接觸性、高死亡率的傳染病，可感染犬科(犬、貉)、鼬科(水貂、雪貂)等多種動(dòng)物。由于犬瘟熱各毒株之間存在毒力的不同，我們把毒力低而具有較好免疫原性的毒株作為弱毒疫苗株，毒力強(qiáng)的作為強(qiáng)毒株。犬瘟熱病毒感染的動(dòng)物晚期會(huì)出現(xiàn)非常明顯的臨床癥狀，并且死亡率高，難以治愈，因此建立早期CDV野毒株與弱毒疫苗株的病原

2、學(xué)診斷方法是控制犬瘟熱流行的重要環(huán)節(jié)。本研究獲得以下結(jié)果：
　?。?）本研究根據(jù) Genebank公布的犬瘟熱毒株的全基因序列比對(duì)，選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)了一對(duì)通用引物M1和M4，并在這對(duì)通用引物中分別設(shè)計(jì)了犬瘟熱的強(qiáng)弱毒株的特異引物M2和M3。應(yīng)用該方法強(qiáng)弱毒株的最低檢出限度在10拷貝，分別比常規(guī) RT-PCR高出100倍和1000倍，特異性良好，對(duì)175份犬瘟熱疑似病料分別進(jìn)行了SYBR Green I熒光定量RT-PCR和常規(guī)RT

3、-PCR檢測(cè)，分別檢出127份樣品和112份樣品，并且在127份陽(yáng)性病料中有29份為疫苗株。結(jié)果表明該方法的敏感性高于常規(guī)RT-PCR，并能有效的鑒別區(qū)分強(qiáng)弱毒株。
　?。?）本研究根據(jù)Genebank公布的犬瘟熱毒株H基因全基因序列比對(duì)，在其突變區(qū)域設(shè)計(jì)探針，兩邊保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物的方法，設(shè)計(jì)了兩套引物及探針。通過對(duì)這兩套引物及探針進(jìn)行篩選，最終出一套 CT值最小及熒光強(qiáng)度高的探針，進(jìn)行優(yōu)化確定了條件，使用MEGAscript?

4、Kit試劑盒將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為RNA，其最低檢測(cè)限度為10拷貝數(shù)，強(qiáng)弱毒株都比常規(guī)RT-PCR高出100倍，特異性良好，對(duì)175份臨床病料檢測(cè)出135份陽(yáng)性病料，其中有30份為疫苗株引起的。結(jié)果分析此方法具有良好的敏感行高于SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，能有效的區(qū)分強(qiáng)弱毒株。
　　（3）對(duì)已經(jīng)建立的兩種熒光定量方法檢測(cè)出來(lái)的強(qiáng)毒株，選取其中15株野毒株進(jìn)行H基因測(cè)序分析，結(jié)果顯示山東地區(qū)的基因型屬于Asia-1型