病毒樣顆粒包裝鋅指核酶形成假病毒及其對HPV16陽性細胞的殺傷研究.pdf

1、目的：
　　1.前期工作中已經(jīng)通過分析HPV16中癌基因E7的序列信息，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建靶向于不同靶點的鋅指核酶質(zhì)粒，利用體外的報告體系初步篩選出切割效率最好而毒副作用最小的ZFNs對，同時通過對ZFN的切割域和骨架系統(tǒng)進行優(yōu)化，篩選出切割效率最高的ZFN對，此項工作已經(jīng)在前期完成。
　　2.建立VLPs假病毒感染細胞的陽性體系。通過應(yīng)用HPV16的VLPs包裝PrwB紅光質(zhì)粒，得到VLP-PrwB的假病毒。產(chǎn)生的假病毒進行

2、收獲及純化，純化后的產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)染各個細胞系，通過紅光的觀察來驗證VLPs-PrwB假病毒的感染效率。包裝純化后的VLPs-PrwB可以作為后期包裝的陽性對照。
　　3.將ZFN目的片段取代PrwB的紅光序列，構(gòu)建到PrwB載體上，形成的質(zhì)粒用VLPs進行包裝，包裝后的產(chǎn)物進行收獲以及純化，然后純化產(chǎn)物對不同細胞進行感染，驗證ZFNs對HPV16 E7的切割效果。
　　方法：
　　1.前期實驗中已得切割效率最好而毒副作用

3、最小的ZFN對ZFN-L和ZFN-R。
　　2.構(gòu)建VLPs包裝的陽性質(zhì)粒：用p16L1L21質(zhì)粒和PrwB質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝工具細胞293FT。轉(zhuǎn)染的p16L1L2質(zhì)粒在293FT中表達出L1和L2蛋白，并且組裝成HPV16的衣殼。衣殼組裝過程中，將目的質(zhì)粒PrwB包裝進入衣殼中形成VLP-PrwB假病毒。包裝好的VLP-PrwB假病毒進行收集及純化。純化后的VLP-PrwB假病毒感染293細胞確定感染的有效滴度。確定滴度后的 VL

4、P-PrwB假病毒感染 SiHa， HeLa，C33-a和293等細胞后，觀察其中紅光的發(fā)光效率的方法確定其感染效率。
　　3.通過對之前驗證針對 HPV16 E7有效的鋅指核酶目的片段進行擴增，連接構(gòu)建到PrwB的骨架載體上，分別命名為ZFN-L和ZFN-R。
　　4.構(gòu)建VLPs包裝ZFN-L和ZFN-R：用p16L1L2質(zhì)粒和ZFN-L和ZFN-R質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝工具細胞293FT。p16L1L2質(zhì)粒在293FT中表達出

5、L1和L2蛋白包裝ZFN-L和ZFN-R質(zhì)粒形成VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒。包裝好的VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒進行收集及純化。純化后的 VLP-ZFN-L和 VLP-ZFN-R假病毒對SiHa，HeLa以及C33-a細胞進行感染。（1）T7E1實驗檢測經(jīng)VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒共同感染的細胞系中DNA是否存在有DNA被切割形成雙鏈斷裂（double strandes break，D

6、SB）并導(dǎo)致同源重組（homologous recombination， HR）以及非同源性末端連接（Non-homologous end joining， NHEJ）。（2）細胞凋亡可以顯示VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒共同感染細胞之后，細胞的凋亡情況。（3）克隆形成實驗可以通過VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒感染細胞之后，通過對細胞進行消化以及種植到孔板后，觀察細胞克隆的形成個數(shù)從而得到假病毒對細胞的增殖能

7、力的影響。（4）western blotting檢測VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒感染細胞之后細胞中HPV16的E6，E7蛋白以及和E7相互作用的pRb蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　　1.利用VLPs包裝的PrwB質(zhì)粒形成的VLP-PrwB假病毒，經(jīng)過收獲以及純化之后，能使得感染的細胞發(fā)紅光。說明VLPs包裝PrwB質(zhì)粒形成的VLP-PrwB假病毒能夠感染細胞，并且其中包裝的質(zhì)粒可以在宿主細胞內(nèi)進行表達。成功建立

8、VLPs包裝質(zhì)粒形成假病毒的體系，以及作為包裝其他質(zhì)粒形成假病毒的陽性對照。
　　2. VLP-ZFN-L和VLP-ZFN-R假病毒一起感染SiHa，HeLa和C33-a，其中的ZFN質(zhì)粒能夠進入細胞內(nèi)表達出相應(yīng)蛋白，形成鋅指核酶的識別序列以及切割序列，有效的切割DNA靶序列，從而引起：（1）HPV16 E7的序列形成DSB，繼而激活細胞內(nèi)DNA的修復(fù)機制，從而導(dǎo)致HR以及NHEJ。這種效果在HeLa和C33-a中并沒有出現(xiàn)，說明

9、鋅指核酶切割的特異性。（2）VLP-ZFNs感染導(dǎo)致SiHa細胞的凋亡增加，但是HeLa和C33-a中并沒有出現(xiàn)明顯的凋亡。（3）VLP-ZFNs感染細胞之后，SiHa細胞的克隆形成明顯減少，但是對HeLa和C33-a的克隆形成的影響并不大。（4）western blotting檢測HPV16的E6，E7及相關(guān)蛋白時候發(fā)現(xiàn)，假病毒感染的SiHa細胞E7蛋白量表達下降，pRb蛋白表達量上升，而HeLa和C33-a的變化不大。
　　討

10、論：
　　1.綜上所述，通過對VLP-PrwB假病毒進行包裝，證實VLP可以攜帶目的質(zhì)粒形成假病毒。這種假病毒可以感染目的細胞，并使目的基因在靶細胞進行表達。證明了VLP包裝形成假病毒的可行性以及該體系的建立，為后期的實驗建立了陽性對照。
　　2.通過VLP包裝ZFNs形成VLP-ZFNs假病毒，這種假病毒可以感染SiHa細胞，并且其中的ZFNs可以在細胞內(nèi)表達，ZFNs表達形成的蛋白可以針對特定序列進行切割，本實驗中設(shè)計的