兔出血癥病毒單克隆抗體的制備及抗原捕獲ELISA檢測方法的建立.pdf

1、兔出血癥(Rabbit haemorrhagic disease,RHD)是由兔出血癥病毒(Rabbit haemorrhagic disease virus，RHDV)引起的兔的一種急性、敗血性、高度致死性傳染病。該病于1984年在中國首次發(fā)現(xiàn)，其后在世界其它地區(qū)相繼發(fā)生，給養(yǎng)兔業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 鑒于RHD病程短、致死率高等特點(diǎn)，臨床檢測和早期診斷中對檢測方法除要求敏感、準(zhǔn)確外，還要求其快速化、簡單化?，F(xiàn)有的血清學(xué)檢測

2、方法因?yàn)樯虡I(yè)養(yǎng)殖中對兔的嚴(yán)格免疫導(dǎo)致其無法判定是病毒感染還是疫苗免疫造成了抗體水平的升高而失去了其診斷意義。因此，在RHD的診斷中病原學(xué)檢測發(fā)揮著主導(dǎo)作用。目前，已建立了多種實(shí)驗(yàn)室檢測方法，其中瓊脂擴(kuò)散、血凝/抑制試驗(yàn)應(yīng)用較廣但靈敏性較低；反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)因儀器、試劑和操作技術(shù)要求更適合于實(shí)驗(yàn)室操作，相比之下酶標(biāo)抗體技術(shù)操作相對簡單又無需太多實(shí)驗(yàn)設(shè)備，比較適合在臨床和檢測中推廣。然而迄今為止，只有國外少數(shù)公司研制成

3、功了抗原檢測ELISA試劑盒，其昂貴的成本使其在進(jìn)行大規(guī)模臨床檢測時(shí)難以廣泛應(yīng)用。因此，研制靈敏、快速、操作簡便的抗原檢測ELISA試劑盒對于RHD的診斷和疫情防制具有重要意義。 本試驗(yàn)以分離純化的地方毒株RHDV-TP株免疫BALB/c小鼠，制備了多株針對RHDV的單克隆抗體，對其生物學(xué)特性進(jìn)行分析鑒定后，篩選出一株效價(jià)高、親和力強(qiáng)的單克隆抗體DE<,2>株，并將其作為診斷試劑，建立了RHDV抗原捕獲ELISA檢測方法。

4、 由于RHDV缺乏體外繁殖系統(tǒng)，本試驗(yàn)將RHDV-TP毒株攻擊健康大白兔增殖病毒，發(fā)病死亡后采集其肝臟組織勻漿處理，以蔗糖密度梯度離心法純化RHDV全病毒粒子，并將其作為免疫原免疫BALB/c小鼠。以真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的RHDV結(jié)構(gòu)蛋白-VP60作為基礎(chǔ)建立間接ELISA檢測方法進(jìn)行單抗篩選。通過融合與克隆過程，篩選出6株針對RHDV的單克隆抗體AD<,4>、AG<,10>、BC<,9>、BE<,8>、BH<,3>、DE<,2>；其腹水

5、效價(jià)介于1：400～1：3×10<'4>之間。競爭相加ELISA及Western-blot試驗(yàn)結(jié)果表明，6株單抗分別針對5個(gè)RHDV抗原位點(diǎn)，其中DE<,2>株針對線性抗原位點(diǎn)，DE<,2>株效價(jià)較高、親和力強(qiáng)，有作為診斷試劑進(jìn)行開發(fā)利用的前景。 將DE<,2>株單抗腹水純化后作為捕獲抗體包被酶標(biāo)板，建立了抗原捕獲ELISA診斷方法檢測RHDV，并對各工作條件進(jìn)行了優(yōu)化，篩選出最佳工作體系，然后以對已知陽性抗原樣品和陰性抗原樣品

6、及臨床可疑樣品進(jìn)行檢測，并與常規(guī)血凝/血凝抑制試驗(yàn)檢測結(jié)果進(jìn)行比對。結(jié)果顯示對于已知陽性樣品，捕獲ELISA陽性檢出率為100％；對于臨床可疑樣品，捕獲ELISA陽性檢出率為62.7％，常規(guī)血凝試驗(yàn)為55.2％，檢出率比HA高7.5％，靈敏度為HA試驗(yàn)的3～13倍。最低病毒檢出量測定試驗(yàn)表明，抗原捕獲ELISA診斷方法對全病毒的最低檢出濃度為26ng/mL，具有很高的靈敏度。上述結(jié)果表明，基于DE<,2>株單克隆抗體的抗原捕獲ELISA