建立檢測(cè)病毒性出血熱的Luminex液相芯片技術(shù).pdf

1、病毒性出血熱(Viral hemorrhagic fevers，VHFs)是一類由病毒引起的，臨床癥狀主要表現(xiàn)在發(fā)熱和出血的一類疾病。這類疾病通常伴有休克等癥狀，病死率高，危害嚴(yán)重。引起病毒性出血熱主要包括數(shù)十種病毒的五個(gè)不同病毒科:布尼亞病毒科、沙粒病毒科、絲狀病毒科、黃病毒科及彈狀病毒科。至今，在我國(guó)流行的病毒性出血熱主要有腎綜合征出血熱、新疆出血熱、登革出血熱及2010年在我國(guó)發(fā)現(xiàn)的一種新型布尼亞病毒——發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼

2、亞病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)等。目前對(duì)病毒性出血熱的治療方法有限，除個(gè)別病毒外，大部分沒有有效的疫苗可進(jìn)行防治。多數(shù)感染者早期沒有明顯的臨床特征，類似于流感。因此建立快速、靈敏的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法對(duì)于病毒性出血熱疾病的治療和控制具有重要的意義。
　　目前，實(shí)驗(yàn)室主要是通過病毒分離、PCR、ELISA等方法對(duì)病毒性出血熱進(jìn)行診斷。病毒分離被認(rèn)為是

3、診斷病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但其病毒分離實(shí)驗(yàn)過程耗時(shí)較長(zhǎng)，而其他的檢測(cè)方法因其無(wú)法同時(shí)進(jìn)行多重檢測(cè)，且需大量的臨床樣本和人力操作等缺陷。目前，本實(shí)驗(yàn)室已初步建立病毒性出血熱多重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)方法和懸浮芯片技術(shù)診斷病毒性出血熱多重血清學(xué)方法。為實(shí)現(xiàn)病毒性出血熱核酸的多重檢測(cè)及解決臨床早期機(jī)體內(nèi)抗體的存在問題，本實(shí)驗(yàn)的目的是建立基于液相芯片技術(shù)對(duì)病毒性出血熱核酸進(jìn)行多重檢測(cè)的方法。
　　液相芯片技術(shù)是20世紀(jì)70年代中期由美國(guó)Lu

4、minex公司開發(fā)的一種高通量檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，它可以實(shí)現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)完成100種不同分析物的定性、定量檢測(cè)分析，具有快速、操作簡(jiǎn)單、高通量、高靈敏度、高信噪比、節(jié)省標(biāo)本及時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外研究較多的是應(yīng)用于蛋白質(zhì)的檢測(cè)，如細(xì)胞因子的活動(dòng)水平檢測(cè)、腫瘤標(biāo)記物、激素水平的檢測(cè)等。
　　發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒是我國(guó)首先發(fā)現(xiàn)的具有重要公共衛(wèi)生意義的新型布尼亞病毒，能夠引起以發(fā)熱伴血小板和白細(xì)胞減少以及消化道癥狀為主要臨

5、床表現(xiàn)的病毒性疾病。作為一種新發(fā)現(xiàn)的全新病原體，SFTSV的復(fù)制、傳播與致病等方面的機(jī)制均需進(jìn)一步闡釋，不同的細(xì)胞嗜性有可能是導(dǎo)致宿主發(fā)病、多器官受損乃至死亡的重要原因之一，研究SFTSV對(duì)體外培養(yǎng)的不同種類細(xì)胞的嗜性及對(duì)宿主細(xì)胞的影響，對(duì)開展相關(guān)基礎(chǔ)研究，了解其致病機(jī)制及其防控具有重要作用。
　　本研究主要分為兩大部分:
　　第一部分:通過NCBI網(wǎng)站下載31種病毒性出血熱病毒的全基因序列，經(jīng)軟件分析，在各出血熱病毒基因保

6、守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，用軟件對(duì)引物和探針進(jìn)行初步分析。利用體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增后，與標(biāo)記探針的微球雜交，進(jìn)行液相芯片檢測(cè)。初步建立了基于液相芯片技術(shù)檢測(cè)病毒性出血熱核酸的方法，評(píng)價(jià)引物探針對(duì)檢測(cè)的特異性和靈敏度，利用部分臨床血清樣本對(duì)方法的實(shí)用性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。
　　第二部分:通過不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection)的SFTSV感染Vero等10種不同組織來源的細(xì)胞株，采用雙