根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因遺傳轉(zhuǎn)化水稻的研究.pdf

1、水稻是一種世界性的重要糧食作物,是我國(guó)近50％食糧的來(lái)源.水稻生長(zhǎng)季節(jié)受多種脅迫因素的影響,其中冷害是影響水稻單產(chǎn)的主要因子之一,培育抗冷水稻品種是生產(chǎn)實(shí)踐的迫切需要.本實(shí)驗(yàn)研究了秈稻再生組培體系、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系中影響基因轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)因素,為秈稻轉(zhuǎn)化效率的提高提供了依據(jù).應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法,將帶有細(xì)胞分裂素合成代謝的關(guān)鍵酶基因(ipt)與抗除草劑基因(bar)構(gòu)建成融合基因表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌(EHA105/pBinb

2、aript)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化粳稻品種EY105、秈稻品種CDR22、DUOXI1、K17B的愈傷組織和成熟胚,獲得PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株(EY105)和CDR22表型變化的植株,為進(jìn)一步鑒定篩選抗低溫的轉(zhuǎn)基因種質(zhì)資源和育種新材料奠定基礎(chǔ).主要研究結(jié)果如下:1、水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)及分化研究以CDR22、K17B、DUOXI Ⅰ等秈稻品種為材料,研究了不同培養(yǎng)基等因素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、分化和再生的影響.結(jié)果表明,采用DNB(N<,6>鹽+

3、B<,5>維生素+水解酪蛋白500mgL<'-1>+脯氨酸500mg L<'-1>+谷氨酰胺300mg L<'-1>+甘露醇36.4gL<'-1>+蔗糖30gL<'-1>+2,4-D 2mg L<'-1>+0.2 mg L<'-1>6-BA+植物凝膠2.5g L<'-1>,pH 5.8)為誘導(dǎo)培養(yǎng)基,DMS(MS+水解酪蛋白500mgL<'-1>+脯氨酸500mgL<'-1>+谷氨酰胺300mg L<'-1>+甘露醇36.4gL<'-1

4、>+蔗糖30g L<'-1>+2,4-D 2mg L<'-1>+0.2 mgL<'-1>6-BA+植物凝膠2.5gL<'-1>,pH 5.8)與DNB培養(yǎng)基交替繼代,秈稻愈傷組織誘導(dǎo)率高、質(zhì)量較好;采用MSR<,3><'c>(MS+水解酪蛋白500mg L<'-1>+谷氨酰胺300mg L<'-1>+脯氨酸500mg L<'-1>+甘露醇36.4g L<'-1>+麥芽糖30g L<'-1>+TDZ0.2mg L<'-1>+植物凝膠5gL

5、<'-1>pH5.8)為分化培養(yǎng)基,愈傷組織分化率可達(dá)90％,較對(duì)照MSR1提高3~5倍.2、受體材料對(duì)除草劑本底抗性的測(cè)試將愈傷組織分別接種到含不同濃度Glufosinate ammoniun的篩選培養(yǎng)基上,測(cè)試其對(duì)愈傷組織抑制效果.結(jié)果表明,Glufosinate ammoniun對(duì)愈傷組織的選擇壓以4 mgL<'-1>為適宜.3、農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化條件的研究通過(guò)AS、菌液濃度、共培養(yǎng)時(shí)間等因素對(duì)轉(zhuǎn)化的影響實(shí)驗(yàn),初步確定了愈傷組

6、織篩選及分化培養(yǎng)基附加除草劑(Glufosinate ammoniun)4 mgL<'-1>、頭孢霉素300mgL<'-1>、愈傷組織預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2~3天、共培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮的濃度為39 mgL<'-1>、共培養(yǎng)2~3天、菌液OD<,600>為0.5.4、轉(zhuǎn)化植株的獲得及PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化ipt基因所得的除草劑抗性再生植株中,獲得ipt的PCR檢測(cè)陽(yáng)性植株1株;另一途徑采用成熟胚直接感染,經(jīng)過(guò)愈傷誘導(dǎo)、除草劑篩選,得到1株表型變化的植