根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的中國(guó)石竹遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及幾丁質(zhì)酶基因的導(dǎo)入.pdf

1、中國(guó)石竹(Dianthuschinensis)原產(chǎn)中國(guó)，是園林綠化中較好的地被材料，但在栽培過程中發(fā)現(xiàn)在潮濕溫暖環(huán)境下，易染石竹葉斑病。幾丁質(zhì)酶是植物受病原菌侵染后誘導(dǎo)產(chǎn)生的，雖然植物本身未發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)，但很多植物病原菌細(xì)胞壁的主要成分是幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)酶可抑制一些病原菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)。目前在植物抗病基因工程中，幾丁質(zhì)酶基因的應(yīng)用效果顯著，多種轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因植物的抗病性明顯高于對(duì)照。本試驗(yàn)試圖采用基因工程的方法，初步建立中國(guó)石竹的遺傳轉(zhuǎn)

2、化體系，并將玉米幾丁質(zhì)酶基因?qū)胧瘢垣@得抗病的石竹品種。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.建立起以葉片為外植體的高頻再生體系取頂芽下第二三對(duì)葉片，以遠(yuǎn)軸面和培養(yǎng)基接觸的方式在MS1(MS+0.1mg/LBA+1.0mg/L2,4-D)中預(yù)培養(yǎng)3d后，轉(zhuǎn)入MS2(MS+1.0mg/LBA+0.3mg/LNAA)中分化培養(yǎng)，獲得了68.3﹪的再生頻率。 2.建立了以葉片為受體的遺傳轉(zhuǎn)化體系用pBI121/LBA4404對(duì)影響石竹轉(zhuǎn)化效

3、率的因素進(jìn)行比較試驗(yàn)，確定的轉(zhuǎn)化條件為：切取轉(zhuǎn)化受體材料在MS1中預(yù)培養(yǎng)3～4d。將二次活化至OD600=0.5的菌液離心，重懸于相同體積添加100μmol/L乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基中，將預(yù)培養(yǎng)葉片放入其中，侵染6～8min，滅菌濾紙吸干，放入添加100μmol/L乙酰丁香酮的水中共培養(yǎng)(濾紙為基質(zhì))，暗培養(yǎng)3～4d。共培養(yǎng)結(jié)束后，將葉片在附加500mg/LCef的1/2MS液體培養(yǎng)基中輕輕振蕩洗滌10min，滅菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)入MS

4、2+50mg/LKm+400mg/LCef中進(jìn)行篩選分化培養(yǎng)，出芽后轉(zhuǎn)入MS6(MS+0.5mg/LBA+0.3mg/LNAA+50mg/LKm+200mg/LCef)中進(jìn)行增殖篩選。再生芽轉(zhuǎn)入生根篩選培養(yǎng)基MS7(1/2MS+25mg/LKm)中進(jìn)行生根篩選。 3.兒丁質(zhì)酶基因的導(dǎo)入及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定在建立起的石竹轉(zhuǎn)化體系上，將幾丁質(zhì)酶基因?qū)胧?，葉片平均再生率為6.9﹪，共獲得25株生根的抗性植株。PCR檢測(cè)顯示，其中5株