小鼠胚胎干細胞直接誘導分化為功能性肝臟細胞的研究.pdf

1、目前，對于肝功能衰竭(如肝壞死、肝硬化等)和肝臟相關的遺傳性疾病的治療主要依賴于原位肝移植，但供體肝來源嚴重不足和移植排斥等問題限制了這一治療手段的廣泛開展。肝細胞移植和生物人工肝作為肝移植的輔助方式，可以部分緩解上述問題，但其來源細胞同樣也面臨著存活期短，特別是隨著培養(yǎng)時間的延長，肝功能逐漸降低等問題，因此，尋找合適的肝細胞來源已成為一個十分緊迫的課題。 胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESCs)是來源于囊

2、胚內細胞團的一種高度未分化細胞，具有無限增殖和發(fā)育全能性等特點，可白發(fā)分化為多種細胞類型，在特定的誘導條件下，也可以向某種組織細胞類型分化。目前，已知ESCs可定向分化為神經細胞、心肌細胞、造血細胞、平滑肌細胞、軟骨細胞等多種細胞類型。在非肝源性肝干細胞研究領域，自從2001年Harnazaki等[1]首次報道誘導ESCs分化為肝臟細胞以來，ESCs源性肝臟細胞的體外研究在多個研究中心迅速開展起來，目前已明確可以由ESCs獲得表達肝臟特

3、異性標志物的肝細胞樣細胞。但至今仍沒有建立一個統(tǒng)一高效的誘導胚胎干細胞向肝細胞分化的培養(yǎng)體系。 本課題擬運用不經過擬胚體(Embryoid body, EBs)途徑的直接誘導方法，探討表觀遺傳修飾物質下酸鈉(sodium butyrate，SB)聯合多種細胞因子體外誘導小鼠胚胎干細胞分化為功能性肝臟細胞可行性，建立有效的誘導胚胎干細胞向肝細胞分化的培養(yǎng)體系。并在此研究基礎上，利用在誘導過程中消化傳代的方法，提高ESCs源性肝臟細

4、胞的獲得效率，解決由于長時間誘導帶來的如細胞老化、功能下降等一系列問題，從而為將來ESCs源性肝臟細胞移植治療各種難治性肝病提供理論和實驗依據。 小鼠胚胎干細胞直接誘導分化為功能性肝臟細胞 目的： 運用直接誘導的方法，探討表觀遺傳修飾聯合多種細胞因子體外誘導小鼠胚胎干細胞分化為功能性肝臟細胞可行性，建立有效誘導胚胎干細胞向肝細胞分化的培養(yǎng)體系。 方法： 用RT—PCR檢測pou5f1基因的表達鑒定

5、E14小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESCs)的未分化特性，然后常規(guī)培養(yǎng)增殖ESCs。誘導開始：傳代ESCs，消化成單細胞懸液后以1×104的密度種入6孔板，按誘導進程依次添加：堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、丁酸鈉(sodium butyrate，SB)、骨形態(tài)形成蛋白—4(bone morphogenic protein—4，BMP—4)、肝

6、細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、制瘤素(oncostatin M，OSM)地塞米松(Dexamethasone，Dex)進行分組誘導，整個誘導過程持續(xù)十六天。分化過程中用光學顯微鏡觀察各組細胞密度及形態(tài)學改變；RT—PCR檢測各組肝細胞特異性標志基因白蛋白(albumin，ALB)、甲胎蛋白(α—fetoprotein，AFP)、甲狀腺素運載蛋白(transthyretin，TTR)、α1抗胰蛋

7、白酶(α1-antitrypsin，AAT)、酪氨酸轉氨酶(tyrosine aminotransferase，TAT)、肝細胞核因3p(hepatocyte nuclearfactor3β，HNF3β)、肝細胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor4α，HNF4α)、細胞角蛋白18(cytokeratin18，CK18)、細胞角蛋白19(cytokeratin19，CK19)、膽固醇7α—羥化酶A1(Chole

8、sterol7α—hydroxylaseA1，CYP7A1)的mRNA表達；免疫熒光化學分析檢測肝細胞特異性標志蛋白ALB、AFP、CYP7A1、FⅧ、FⅨ的表達；通過糖原PAS染色試驗和吲哚氰綠攝取試驗檢測誘導分化的細胞是否具有肝臟細胞功能；透射電鏡觀察是否出現肝臟細胞樣的超微結構。 將誘導7-8天的細胞按1:3比例消化傳代，傳代后繼續(xù)按原方案誘導，誘導過程結束后用血細胞計數器計算未經消化傳代處理和經消化傳代后細胞總數，RT—

9、PCR檢測消化傳代處理對于肝臟特定基因表達的影響。 結果： 1.分組誘導結果 1.1光鏡結果 1.1.1細胞密度 以1×104的密度種入6孔板，觀察發(fā)現從第二天開始D組和E組死亡細胞增多，第五天換液后，各孔均出現較多的死亡細胞，第六天，死亡細胞逐漸減少，經過八天誘導后，D組和E組的細胞密度仍低于其他組，第九天改換含有HGF的培養(yǎng)液后，各皿又出現較多死亡細胞，但此時，各孔細胞均已鋪滿皿底，繼續(xù)誘導發(fā)

10、現，隨著誘導時間的延長，細胞常由于密度過大，聚集成團，有些團塊內部發(fā)黑。 1.1.2細胞形態(tài) 誘導開始，撤除LIF，加上各組誘導液，單個細胞逐漸由圓形或類圓形轉變成多角形，發(fā)生分化，第一天即可見D組和E組有多數細胞開始分化，分化細胞比例明顯多于其他組別，三天后，可見D組和E組細胞形態(tài)與其他組別相比，突起更長，第六天，各組均可見多角形細胞，第八天，A組、B組細胞類型較其他組別復雜，C組、D組和E組均可見有鋪路石狀排列緊密的

11、肝細胞樣細胞，但C組和E組的細胞均一性優(yōu)于D組。誘導至十四天后，細胞形態(tài)無明顯改變，但各組細胞均有空泡樣變，折光率下降。 1.2 RT—PCR結果 隨著誘導時間的推進，標志肝臟細胞發(fā)育過程的ALB、AFP、TTR、AAT、TAT、HNF3β、HNF4α、CYP7A1、CK18、CK19的mRNA表達量在各組間有較大差別。 1.3免疫熒光化學檢測結果 誘導分化細胞中的部分細胞ALB、AFP、CYP7A1、F

12、Ⅷ、FⅨ表達為陽性。 1.4功能檢測結果 誘導分化細胞具有糖原合成和吲哚氰綠攝取功能。 1.5電鏡結果 誘導分化細胞內具有大量線粒體、粗面內質網、糖原粒以及微絨毛等肝細胞的形態(tài)學特點。 2.消化傳代處理結果 2.1細胞計數結果 表2誘導16天后消化處理組和未經消化處理細胞組細胞總數比較組別 第一組：消化處理組(3孔總數)4.8×1064.65×1064.11×106

13、 第二組：未經消化處理組(1孔數)2.09×1061.96×1062.11×106 統(tǒng)計軟件采用SPSS13.0 for Windows，經t檢驗，P值小于0.01，消化傳代處理和未經消化傳代處理細胞總數有顯著差異。 2.2 RT—PCR結果： 經消化傳代后的細胞ALB、TTR、AAT、TAT、HNF3β、HNF4α、CK19的mRNA表達量均高于未經消化處理的細胞。 結論： 1.加入丁酸鈉、bF